液氮冷冻保藏技术
(二)、纤维素酶研究情况
2.1 纤维素酶简介
2.1.1纤维素
纤维素占植物干重的35%~50%，是地球上分布最广的碳水化合物。它无色、无味，呈白色丝状，不溶于水及一般的有机溶剂。纤维素分子是由葡萄糖苷通过β-1,4糖苷键连接起来的链状高分子，分子量50000~2500000，相当于300~15000个葡萄糖基，不形成螺旋构象，没有分支结构，易形成晶体。
徐州工程学院教案
2014年至2015年第1学期第周星期
课题名称（含教材章节）：《酶工程实验》
实验一产纤维素酶菌株筛选和产酶条件优化分析
教学目的和要求：1、熟悉功能性菌株筛选方法
2、掌握纤维素降解菌株的筛选方法
3、掌握菌株产酶条件优化方法
教学重点：酶工程研究开发的策略
教学难点：产酶条件优化方法
教学内容（要点）
2.1.2纤维素酶
纤维素酶是能将纤维素水解成还原糖的一类酶系的总称。目前普遍认为要完全降解纤维素，至少需要3种功能不同的酶协同作用。它们是 EG(内切葡聚糖酶)、CBH(外切葡聚糖酶)和 CB(β-葡萄糖苷酶)。
2.2 纤维素酶的应用
2.2.1在能源方面的应用
2.2.2在其他方面的应用
纤维素酶已被广泛的应用于食品、酿造、农业、纺织、洗衣等多个领域中。
2.2.3纤维素酶应用中存在的问题
纤维素酶作为能够有效降解纤维素的酶类，无论在动物生产还是环境保护中都确实起到了一定的作用，有非常好的应用前景。但是纤维素酶在大规模工业化生产应用中很大程度上受到其活性和成本的限制。目前，对于纤维素酶的研究也仍然存在菌株产酶效率低、生产成本高、作用于动物的机理尚未完全清楚等问题，这些问题严重制约着纤维素酶的推广应用。
(6)产生的酶便于分离和提取，得率高；
(7)微生物培养营养要求低。
(六) 最佳产酶条件的初步确定
(1)培养方式的确定；
(2)最佳培养条件组合；
(3)微生物产酶的特性(胞内酶、胞外酶)；
(4)微生物酶收集的时间顺序；
(七) 微生物产酶性能的进一步提高
(1)获得高产菌种的突变体；
(2)利用代谢工程和代谢调节机理来提高微生物的酶产量；
纤维素酶的基因克隆为研究纤维素酶的生物合成和作用机制，以及了解纤维素酶遗传特性进而构建高效纤维素分解菌开辟了新的途径。国内外已开展了大量的相关研究，随着研究领域不断扩大，也取得了一定的新进展。随着生物技术的发展和酶应用技术研究的深入，纤维素酶一定会在各类大规模工业化生产中大放异彩。
2.3 产纤维素酶菌株的研究进展
(2)微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各个角落，而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同的底物。
(3)为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。
(4)当基因工程介入时，动植物细胞中存在地酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。
因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当细胞。
(3)运用遗传工程、基因工程的手段将原有菌株中的目的基因转移到另外一些对生产环境更适应性的微生物细胞之内，使其高效表达；
(八) 微生物酶的提取方法
(1)酶的粗提；
(2)酶的精制。
(九) 微生物产酶菌种的保藏
(1)斜面；
(2)沙土管；
(3)冷冻。
普通冷冻保藏技术(-20℃)
超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)
食品工业中利用纤维素酶处理植物性原料，可使植物细胞壁软化、崩溃，从而改变细胞壁的通透性，提高细胞内含物如蛋白质、糖等的释放与提取，便于加工。主要采用热烫或者酸碱处理，使得果蔬的香味和维生素大量损失，使产品的食用和营养价值下降。现在利用纤维素酶进行预处理就可以避免这些缺点。
自然界中存在着诸多天然的产纤维素酶的菌株，所以对产纤维素酶菌株的选育也是研究纤维素酶的一个热点。产纤维素酶的菌株主要可以分为以下几类：
1) 真菌类：
丝状真菌是目前研究最多的纤维素降解类群，该类微生物能产生大量的纤维素酶，研究较多的有木霉属、曲霉属、青霉属、根霉属和漆斑霉属。其中尤以木霉属的产量居上，里氏木霉(Trichoderma ressiei)、康氏木霉(Trichoderma koniggii)、拟康氏木霉(Trichodermapseudokoniggii)、绿色木霉(Trichoderma viride)、黑曲霉(Aspergillus niger)等是其中活性较高的代表菌种。
由于畜禽饲料中含有大量的纤维素，除某些反刍动物有分解纤维素的能力外，大部分畜禽没有此能力。纤维素酶能够分解复杂的纤维素，生成易消化物质葡萄糖，便于动物吸收。在饲料中添加了纤维素酶后，其提高家畜家禽生长性能、生产性能等效果显著。
纤维素酶已成为纺织和洗衣行业的第三大酶系。生物打磨和生物抛光是目前纤维素酶在纺织行业中的主要应用。纤维素酶也被用于家用洗涤剂中，因为它们可以增加去污能力，从织物表面去处小的碎纤维，增加织物表面的亮度和光泽。
2、微生物酶开发的一般程序
(一) 样品的采集
采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数量。
(二) 菌种的分离
培养基的确定、培养条件的确定。
(三) 菌种的初筛
(1)用简单的定性反应进行初筛；
(2)在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株或只将其最适菌株的一株纯化分离。
酱油酿造主要利用蛋白酶、淀粉酶等酶类对原料进行酶解,若再使用纤维素酶, 使大豆等原料的细胞膜膨胀软化破坏, 使包藏在细胞中的蛋白质、碳水化合物释放, 这样就可以缩短酿造的时间、提高产率, 同时还提高品质, 使氨基酸还原糖含量增加。
在啤酒、葡萄酒的酿造过程中也使用到纤维素酶。在低质量大麦发芽的过程中加入纤维素酶可水解β-1,3和β-1,4葡聚糖从而帮助大麦发芽。纤维素酶还可以提高啤酒的过滤效率，并能增加葡萄酒的香味。
(四) 菌种的复筛
初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。复筛。
酶活的测定方法的建立尤其重要。
(五) 对复筛获得菌株的要求
(1)不是致病菌；
(2)菌株不易变易和退化；
(3)不易感染噬菌体；
(4)微生物产酶量高；
(5)酶的性质符合应用的需要，而且最好是胞外酶；
1、产纤维素酶菌株的筛选分析
2、菌株产酶条件优化
徐州工程学院教案纸
一、实验目的1、熟悉功能性菌株筛选方法
2、掌握纤维素降解菌株的筛选方法
3、掌握菌株产酶条件优化方法
二、实验原理
(一)、功能性菌株开发策略
1、应用微生物来开发酶的优点
(1)微生物生长繁殖快，生活周期短。因此，用微生物来生产酶产品，生产能力（发酵）几乎可以不受限制地扩大，能够满足迅速扩张的市场需求。