• DNA顺序的组装主要方法： • 全基因组鸟枪法测序 • 改良鸟枪法：大片段克隆法、靶标鸟枪法
1、全基因组鸟枪法测序
鸟枪法的顺序组装是直接从已测序的小片段中寻 找彼此重叠，然后依次向两侧邻接的序列延伸。
DNA的鸟枪法测序的主要步骤
• 第一，建立高度随机、序。 • 第三，序列集合。 • 第四，填补缺口。
新技术方法:
➢ 杂交测序法 ➢ 质谱法 ➢ 单分子测序法 ➢ 原子探针显微镜测序法 ➢ DNA芯片法
1、双脱氧链末端终止法
•是 由 英 国 剑 桥 分 子 生物学实验室的生物 化学家F. Sanger等人 于1977年发明的。
•利 用 双 脱 氧 核 苷 酸 作为链终止物测定 DNA 核 苷 酸 顺 序 的 方法。
1980年诺贝尔奖金获得者F. Sanger
（1）Sanger 双脱氧链末端终止法测定DNA 序列的基本原理：
• 以DNA合成反应为基础，加入ddNTP生成特定
末端不同长短的DNA片段；
• 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核
苷酸的DNA分子。
DNA合成反应
利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的 特 性 ， 在 DNA 合 成 反 应 中 ， 加 入 ddNTP ， ddNTP不存在3′-OH末端，故不能与下一个核 苷 酸 的 5′-P 端 形 成 3′ 、 5′- 磷 酸 二 酯 键 ， 导 致 DNA新链的延伸提前终止于ddNTP 。
（2）双脱氧末端终止法主要步骤
• 单链DNA模板的制备 • DNA模板与测序引物退火 • 延伸-终止反应 • 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 • 放射性自显影 • 阅读板
如何得到单链DNA ？
• 将DNA克隆到质粒载体 • 将DNA克隆到M13噬菌体载体 • 将DNA克隆到酵母自动化
• DNA测序的自动化是在Sanger的双脱氧链
末 端 终 止 法 的 基 础 上 在 1987 年 由 美 国 应 用 生物系统公司进一步发展起来的激光测序 法，其基本原理与末端终止法一样，都是 通过ddNTP竞争性的终止新合成的DNA链。
DNA测序自动化步骤：
Template Primer
dATP dNTP
Polymerase Terminator
A
G
C
T
THE PROCESS
ACTG G C CTAATC GAGTCAGT
TGACCGGA T
C
T
A CC
C
T
A GA AC
G GT T
G G GA
C
T
DNA模板 ATTGCAGTCGAC 生成的新链 TAACGTCAGCTG
T管： TAACGTCAGCT TAACGT T
C管： TAACGTCAGC TAACGTC TAAC
G管： TAACGTCAGCTG TAACGTCAG TAACG
A管： TAACGTCA TAA TA
TAACGTCAGCTG TAACGTCAGCT TAACGTCAGC TAACGTCAG TAACGTCA TAACGTC TAACGT TAACG TAAC TAA TA T
DNA序列 分析技术
鸟枪法测 序技术及 其改良
（一）DNA序列分析技术
• DNA序列测定： • 是指DNA一级结构的测定，是在核酸酶学
和生物化学的基础上，创立并发展起来的 一门重要的DNA技术学。
DNA序列测定的技术
经典方法:
双脱氧链末端终止法(Sanger,1977) DNA化学降解法(Maxam&Gilbert,1977)
基因组学和比较基因组学课件
什么是基因组，基因组学？
• 基因组（Genome）：是指生物体的单倍体细胞
中所有的DNA，包括细胞核内的DNA和各种细 胞器中的DNA，是生物体内遗传信息的集合。
• 基因组学（genomics）：是研究并解析生物体整
个基因组所有遗传信息的一门学科。
基因组学的发展：从序列到功能
基因组计划的主要任务是获得全基因组序 列；
现在的测序方法每次只能测800-1000bp， 大量的测序片段要拼接；
要知道序列在染色体上的位置才能正确拼 接，因此需构建基因组图谱。
教学内容
• 一、高通量DNA序列分析技术 • 二、人类基因组计划 • 三、比较基因组学
一、高通量DNA序列分析技术
DNA 序列分析
4种带有不同荧光染料标记的终止物ddNTPs Sanger测序反应
反应产物电泳分离 激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子，发射出
四种不同波长的荧光 荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序
Template
Primer
Terminator
A
G
C
T
dNTP
Polymerase
THE PROCESS
ACTG G C CTAATC GAGTCAGT
TGACCGGA T
T A
CC
C T
C
G GT T
G G GA
A
C A
G
AC C T
以荧光化合物标记双脱氧核苷酸的自动测序
（二）鸟枪法测序技术及其改良
• 基因组的每条染色体长度可达数百万碱基对以上，
将链终止法测定的小片段DNA组装成真实的排列 顺序是一项浩繁而精细的工作。
结构基因组学 功能基因组学 比较基因组学
结构基因组学
结构基因组学：基因组计划
基因组作图 测定核苷酸序列 基因定位
功能基因组学
功能基因组学：后基因组学（postgenomics)
利用结构基因组学提供的 信息和产物，在基因组系 统水平上全面分析基因的 功能的一门学科。
比较基因组学
比较基因组学：研究不同物种之间在基因组结 构和功能方面的亲源关系及其内在联系的学科。
鸟枪法测序示意图
鸟枪法的优势：
ATP、dATP和ddATP的结构 ATP dATP ddATP
• 这样以待测序列的DNA为模板，加入引物和4种
dNTP（其中一种为α-32P标记），将此反应物分 为4等份，每份内加入一定比例的一种ddNTP， 如此形成A、T、C、G四个反应体系，最后在各 反应体系中加入DNA聚合酶催化DNA片段合成。 这样各反应体系中即可形成以一种ddNTP残基为 3’端结尾的一系列长短不一片段。