生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定
实验报告集
班级生工1411
学号
组别7
姓名
实验室学生守则
一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员
的指导。
二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、
准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。
三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。
凡不按教师的指导擅自操
作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。
四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。
未经允许不得随便挪
动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室
外。
五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和
吃东西。
六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管
理人员报告。
七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、
水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。
预习报告（手写，可自行续页）
实验报告
溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定
一、目的
对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定
二、原理
鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。
1、溶菌酶分离纯化原理：
（1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白
（2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白
2、溶菌酶鉴定分析
（1）考马斯亮蓝法测蛋白含量
（2）分光光度法测定酶活性
（3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度
三、实验材料与方法
1、实验材料与试剂
鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等
2、实验仪器
低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。
3、实验方法
1.新鲜鸡蛋清的制备与粗分离
2. 树脂柱层析分离纯化
（1）D152树脂处理(2)湿装法装柱(3) 上柱离子交换吸附(4) 冲平(5) 洗脱
3.透析与浓缩
(1) 透析除盐(2) 聚乙二醇浓缩
4.蛋白质含量的测定
5.溶菌酶纯度的测定（SDS凝胶电泳）
四、实验结果与分析:
1.蛋白浓度实验结果
（1）蛋白质标准曲线的绘制
管号 1 2 3 4 5 6
0.1mg/mL标准蛋白液(mL) 00.20.40.60.8 1.0
蒸馏水(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
考马斯亮蓝(mL) 4 4 4 4 4 4
蛋白质含量(μg/mL)0 20 40 60 80 100
OD5950 0.222 0.434 0.648 0.802 0.948
（2）待测样品蛋白浓度测定
管号E1 E2 E3 E4
蛋白质待测样品提取液 (mL) 0.1 0.1 0.1 0.1
蒸馏水 (mL) 0.9 0.9 0.9 0.9
考马斯亮蓝 (mL) 4 4 4 4
2.374 1.009 0.038 0.972
OD
595
蛋白质含量(μg/mL)
244.07 101.88 0.74 98.03
分析：由图中数据与制作的蛋白质标准曲线的样品比较可知，经过处理后，E1，E2的蛋白质的含量的数值急剧下降，到E3已经几乎趋于0，可表明溶菌酶粗提取的过程中已经除去了大量的杂蛋白，得到了进一步分离纯化后的蛋白质。
2、酶活力实验结果
酶活力测定结果
根据实验所得的E1 ～ E4各样品，汇总结果如下表所示
分析：由上述数据可知，吸光度值总体呈下降趋势，且随着时间的推移,在杂蛋白提纯后，样品E4的酶活力和比活力较先前的E1和E2有了极大的增长，说明经过提纯后，所需要的酶活性增加，但总活力下降，说明溶菌酶的纯度比较好。
3、电泳实验结果
分析:聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS能够和蛋白质分子结合成复合物，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异，各种蛋白质 SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，只与分子量有关，这种方法常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度。
根据以上原理和上述图片，可观察到，本组所在的11-15泳道，11泳道为标准品，15泳道为样品E1，12到14泳道依次为样品E3，E3，E4，由于人为操作问题导致12-15泳道的结果不是特别清晰，但是仍然能比较蛋白质分子量的大小。
4、回收率与提纯倍数实验结果
样品体积ml 蛋白浓度
mg/ml 总蛋白
mg
酶活力
u/ml
比活力
u/mg
总活力U 回收率% 提纯倍数
E1 V1=57.5 0.244 14.03 31 127.0 1782.5 100% 1
E2 V2=134.8 0.102 13.75 13.3 130.4 1792.8 100.5% 1.03
E3 -- 0.00074 ---- 8 ---- ---- ---- ----
E4 V4=4.2 0.098 0.41 95 973.2 399 22.4% 7.66
分析：从E1到E4阶段，回收率下降，提纯倍数升高，说明在提纯过程中由于人为操作问题，离子交换层析柱底部损坏，导致蛋白质大量流失，所以回收率较低，但是提取的纯度比较高。
五、结论与讨论
由于溶菌酶比较稳定，分子量、等电点等与蛋清中其他蛋白质有较大差异。
因此可以利用常规方法的科学组合分离得到纯度较高、活性较强的溶菌酶。
本实验所采用的从鸡蛋中提取溶菌酶的方法，简单易行，成本低廉、分离周期短、溶菌酶纯度高。
但由于各个实验的要求比较严格，所制得的溶菌酶过程中易因为各种原因而受到损失，实验误差比较大，因此还需要继续研究更为适合规模化生产，提取纯度更高的方法。
参考文献
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