动物细胞培养总结一．实验准备1.实验器械、器皿的清洗和消毒（1）清洗和包装离心管，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。

蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。

取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。

过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。

过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。

玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。

浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。

瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。

浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。

取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。

换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。

（2）消毒灭菌1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。

若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。

若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。

2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。

加温升压之前，先打开排气阀门，加温约半小时后见排气阀处开始排残留在锅内的冷空气，排气五分钟，关闭排气阀，继而开始升压。

灭菌后不要立即打开气阀放气以免水汽喷出。

待自然降温至常压才能打开气阀。

玻璃瓶须拧紧，饭盒，枪头灭菌后放入烘箱烘干备用。

2.无菌间消毒及设备检查用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兑水，抹布、拖把擦洗。

配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔细擦拭CO2培养箱，超净台，超净台内物品，显微镜，桌面，若培养箱内未培养细胞可以再打开高温灭菌模式将培养箱灭菌一次。

用蒸馏水擦拭清洗水浴锅内壁，注意底座不要沾水。

检查CO2总压力表，若读数不足四分之一提前预定CO2瓶，换瓶时需要扳手。

CO2培养箱最下层的增湿盘须定期观察加水，将增湿盘内注入1/2无菌蒸馏水，并将盘直接放置在培养箱中央。

启动培养箱，培养箱接通电源，增湿盘加水，连接好气体供给，检查有无漏气，输入系统设置。

设置温度和二氧化碳。

紫外照射无菌间30分钟，注意屋内不要有人以及培养基等试剂。

3.细胞培养用液的配置及分装RPM1640培养基配制：将干粉型RPM1640培养基溶于总量1/3的去离子水中，再用1/3水冲洗包装内2次，倒入培养基中，以保证所有干粉都溶解成培养液，根据产品说明的要求和实验补加谷氨酰胺和NaHCO3 ,倾斜三角瓶轻轻放入转子，用磁力搅拌器搅拌2h。

用泵使培养基在超净台内通过灭菌的过滤器，过滤除菌，分装后置4度冰箱保存备用。

使用前调pH至，加双抗于培养液中浓度为1%，使用时加胎牛血清10%FBS.胎牛血清FBS的处理：使用前应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体，将胎牛血清放入56度水浴中30分钟，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。

分装前提前2天放4度冰箱解冻，溶解完全后于超净台内分装为25ml每管，留2管放四度备用，余下放-20度冻存。

配制含血清培养基或冻存液前务必提前一天取出分装后的血清四度溶解备用，血清融化很慢。

5%NaHCO3溶液配制：5g NaHCO3，100ml蒸馏水， NaHCO3溶于水后，过滤除菌。

%胰蛋白酶液200ml在超净台内分装成每管1ml或2ml，封口膜封口，-20度备用。

双抗溶液配制：80万单位青霉素加4ml灭菌D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。

100万单位链霉素加5ml灭菌的D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。

两溶液各取混合，加入9mlD-Hanks液，则成含青链霉素各1万单位/ml，分装后置于4度冰箱保存备用。

二．操作步骤注意事项：1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒，烘干。

2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。

3、用完溶剂，培养瓶时，瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。

4、所有物品放入超净台需用酒精棉擦拭，包括手伸出窗口拿取物品再回到窗内时需要重新用酒精棉擦拭。

开始工作：1、实验前换紫外照过的白大褂和拖鞋。

2、戴橡胶手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。

3、取待用的细胞，旋紧瓶盖。

4、胰酶消化缓慢时可以将细胞置于5%CO2、37度培养箱中1min-2min，目的是提高酶活性，促进消化。

1.细胞复苏提前预冷离心机，设参数为4度，1000r/min,5min。

将枪头，装有离心管的饭盒，垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。

超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时取出无血清培养基和含血清培养基37度水浴加热。

关闭紫外，打开风机，升高窗高，点燃酒精灯，用镊子从饭盒中取2个15ml离心管放至试管架，每管加入3ml无血清培养基，提前剪好2条封离心管的封口膜备用。

戴上橡胶手套再套上线手套，用镊子从液氮中取出塑料冻存管，用手拿冻存管迅速浸入37度水浴中，剧烈急速摇晃冻存管，因为有防水胶布缠裹不用担心进水染菌，使其急速融化，注意管内冻存细胞的融化情况。

基本转为液态时将冻存管取出，摘下线手套，冻存管转移至超净台内，用酒精擦手，擦拭冻存管尤其管口，撕下胶布和封口膜，再擦拭管口，整个溶解过程尽量在30s至1min内完成。

(注意：这一步对细胞存活率至关重要。

既要尽快融化以减少融化过程对细胞的损害，又要尽可能减少细胞在较高温度停留的时间以减少DMSO对细胞的毒害，切不可将冻存管放在烧杯内不管。

)打开冻存管管盖，逐滴加入1ml无血清培养基，轻柔地将冻存管内的细胞悬液吸取出来，转移至已备好的离心管内，轻轻摇混匀，盖上管盖，轻轻地上下颠倒混匀。

封上封口膜。

低俗离心1000r/min,5min。

小心地吸出上清液，要求上清液尽可能吸走，同时又不触及管底沉淀的细胞。

（较高要求时可以用手指轻弹离心管管底，将细胞团分散，加入10ml无血清培养基混匀离心10min 弃上清再洗一次，有助于减少DMSO残留。

）加3至5ml培养液至沉淀的细胞，轻轻摇晃使分散成细胞悬液，将细胞转移至培养瓶中，拧紧盖子，转移至培养箱中再反旋拧松半圈，以利于瓶口内外进行气体交换，注意取出培养瓶时须先拧紧瓶口。

37度恒温箱中培养。

第二天观察细胞生长情况。

培养基瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。

收好物品，擦一遍台子，灭酒精灯。

2传代培养附着型胞(adherentcell)传代培养离心法提前预冷离心机，设置好参数4度，1000r/min,5min。

倒液法不需要。

将灭菌枪头，装有离心管的饭盒，新培养皿/瓶,垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。

超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时从冰箱取出PBS,胰酶，含血清培养基于37度水浴加热。

关闭紫外，打开风机和照明，升高窗高，点燃酒精灯，将所需试剂先擦瓶底，放在台子上再擦侧壁一圈，擦瓶口瓶盖，撕下封口膜，再仔细擦一遍瓶口。

用喷过酒精的塑料筐将细胞培养瓶拧紧盖子拿到超净台旁的椅子上放平放稳，每三瓶/皿一摞拿入超净台先擦最下面一个的底部，擦好后放在台面上，擦一摞的侧面一圈，在分别擦底面顶面瓶口，直到所有培养瓶各个面及瓶口擦好，注意不要擦到有marker标记字迹的部位，酒精会擦掉字迹，若擦到字迹待酒精干后立即补写上以防事后记不清。

轻轻倒掉旧培养液，注意不要使液体倒流回来冲击细胞，挂在外壁的残留液滴用酒精棉擦掉,培养瓶可以轻轻翻转瓶子使细胞生长的面在上，顶面在下，液体留至顶面后直接倒掉液体。

加1ml PBS，注意枪冲着不长细胞的培养皿侧壁或翻转培养瓶朝瓶的顶壁或侧壁打入PBS，尽量不碰到瓶口或培养皿，若怀疑碰壁，弃掉枪头。

轻轻摇晃培养皿或瓶，使PBS沾到所有细胞，洗涤细胞一遍，轻轻倒掉PBS。

加入%胰蛋白酶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，若是高倍胰酶先稀释（%为1X胰酶），37℃作用数分钟。

等待消化期间准备好新的培养皿/瓶，每25cm2小皿/瓶加入2ml含血清培养基。

消化中的皿盖好盖子或瓶拧紧盖子，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状，有10%细胞漂动时，倒掉胰酶溶液，加入1ml(25cm2小皿/瓶)含血清之新鲜培养基终止胰酶作用。

(若细胞将要分离而呈现圆粒状且80%细胞漂动，则不移去胰酶，在胰酶作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止胰酶作用，吹打成细胞悬液转移至离心管，封上封口膜，离心后再吸掉上清液。

）轻轻摇晃培养瓶使细胞自瓶壁脱落，以吸管上下轻轻吸放数次以打散细胞团块，注意吹打时有系统性的将所有面积都打到不要集中只吹打一处而一些地方没吹打到，吸和吹时枪头都不要离开液面以减少气泡，气泡多破裂时对细胞有冲击且会增加体积不利于操作，培养瓶吹打时操作角度小不方便，用倒液法（10%细胞漂动即倒掉胰酶加含血清培养基终止消化）时吹打细胞要用二档多吹打几次，用皿或离心法（80%细胞飘动不弃胰酶直接加含血清培养基再离心弃上清）时细胞很容易脱落，可以用一档轻轻吹打，保证所有面积都吹打到即可。

混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，拧紧瓶盖，镜下观察细胞数量多，培养液澄清，若细胞密度过低将影响生长可适当补充细胞悬液，若细胞密度过大将影响迅速生长一天后即需传代，可根据实验适当添加培养基或细胞悬液使生长速度符合预期，转移至CO2培养箱，拧松半圈瓶盖，37度培养。

试剂瓶瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。

密封收好物品。

擦一遍台子，灭酒精灯。

3细胞换液取待用的细胞，旋紧瓶盖。

弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。

用微量枪加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。

用微量枪加入适量的细胞培养液于培养瓶中。

旋紧瓶盖。

将细胞置于5%CO2、37度培养箱，反旋拧松瓶盖半圈，培养。

4细胞冻存1>准备工作：提前一天将血清FBS从-20度取出放在4度冰箱解冻。

选取对生增生期细胞（镜下密密麻麻，胞体突触明显），在收集细胞24h前换液一次。