生物材料溶血性标准化评价方法比较:溶血率法和氰化高铁血红蛋白法张伶俐 朱蔚精 谭言飞 屈树新 张兴栋△(四川大学分析测试中心生物学评价实验室,生物材料工程研究中心,成都 610064) 摘要 采用游离血红蛋白直接测定法即溶血率测定法(根据ISO TR7405)和氰化高铁血红蛋白法(根据ISO 1099324)测定了羟基磷灰石(陶瓷)和胶原(高分子材料)的溶血性能,结果提示这两种方法的结论是一致的,且氰化高铁血红蛋白法较血红蛋白直接测定法有灵敏、稳定、可比性好等优点,值得推广应用。
但它存在着一些标准中尚未明确规定的问题。
作者在大量试验和不违背标准原则的基础上提出了一些改进意见,使它更具有可操作性,以便于标准化评价生物材料的溶血性能。
关键词 生物学评价 血液相容性 溶血试验Com par ison between Hem olysis Percen tage M ea surem en t and Hem iglob i ncyan ide M ea surem en t for Standard iz i ng the Eva lua tion ofHem olytic Properties of B ioma ter i a lsZhang L i ngl i Zhu W e ij i ng Tan Yanfe i Qu Shux i n Zhang X i ngdong∃(B iolog ica l E va lua tion L aborota ry,A na ly sis and T esting Cen ter,E ng ineering R eseach Cen ter in B io m a teria ls,S ichuan U n iversity,Cheng d u 610064,Ch ina) Abstract In th is study,tw o m ethods——the supernatant hemoglobin spectropho tom etry,i.e.hemo lysis percentage m easurem ent(acco rding to ISO TR7405)and the hem iglobincyanide m easurem ent(acco rding to ISO 1099324)——w ere used to assay the hemo lytic p roperties of hydroxyapatite(bi oceram ics)and co llagen(po lym er).T he results show ed that the conclusi ons draw n from using the tw o m ethods w ere basically consistent,and the lat2 ter w as mo re sensitive,stable and comparable.How ever,som e of the p rocedures in the hem iglobincyanide m ethod w ere no t defined in details.So based on our experi m ents w e have offered som e suggesti ons and i m p rovem ents, w h ich do no t deviate from ISO and A STM standards,fo r h iher p racticability of usig it in standardizing the evalua2 ti on of the hemo lytic p roperties of bi om aterials.H em iglobincyanide m easurem ent is w o rthy of w ider app licati on.Key words B i o logical evaluati on H emocompatibility H emo lysis test1 引 言与血液直接或间接接触的生物材料必须评价它的血液相容性。
溶血试验检测生物材料与红细胞的相互作用,是一项非常重要的血液相容性评价试验,也是一项重要的体外粗筛试验。
目前国内外大多采用游离血红蛋白直接测定法即溶血率测定法评价生物材料的溶血性能[1～6],但国际标准化组织(In ter2 nati onal standard o rgan izati on,ISO)于2000年颁布了ISO D IS1099324:2000标准[7],重点推荐了氰化高铁血红蛋白法(hem iglob incyan ide,H i CN),并指∃联系人。
E2m ail:zhangxd@。
T el:028*********明操作程序参考A STM F756293标准[8]。
为了与国际接轨,我国正在准备出台相应的等同标准(GB T16886.42xxxx[9])。
然而,无论是ISO D IS109932 4:2000还是A STM F756293都还有一些问题没有规定和说明,给这一标准的实施带来一定的困难。
比如A STM F756标准要求用3只兔的血分别进行试验,而ISO D IS1099324:2000要求最好用人血,也可以用三只兔的混合稀释血代替人血,因为动物血中兔的溶血性能与人最接近。
其次,A STM F756293和ISO D IS1099324:2000都没有规定无定形材料的检测用量,等等。
本文对H i CN测定法进行了一些探索,重点分析了不同血液来源和不同材料的测定结果,比较了两种方法的优缺点,并且在不违背标准原则的基础上提出了一些建议,以便更好地贯彻实生物医学工程学杂志J B i om ed Eng 2004;21(1)∶111～114 施新颁布的标准(GB T16886.4)。
2 材料和方法2.1 材料和仪器选择了两大类生物材料。
第一类是羟基磷灰石(H ydroxyap atite,HA)生物陶瓷,白色颗粒状,51 mm,其阴性对照选用氧化铝陶瓷,呈白色砂粒状。
第二类是医用高分子胶原(co llagen),白色片状,厚度大于0.5mm,其阴性对照选用医用输血袋聚氯乙烯(Po lych lo rovinyl,PV C),无色透明片状,厚度小于0.5mm。
新鲜兔血取自附有健康合格证的大耳白兔,人血取自某单位健康体检人群。
可见与紫外分光光度计(UV755B型,上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂制造,中国测试技术研究院检定)被用于本试验。
2.2 氰化高铁血红蛋白法(H i CN法)[7～10]2.2.1 材料的准备 颗粒或砂粒状材料取1g放入一只试管中,蒸馏水洗3次,生理盐水洗3次,生理盐水浸泡5m in,沥干备用。
厚度大于0.5mm的片状材料取15c m2(单面面积),厚度小于0.5mm 的取30c m2(单面面积)放入一只试管中。
每种材料准备6个试管。
2.2.2 血液的准备 抗凝剂用肝素或A CD液(枸橼酸4.7g L,枸橼酸钠13.3g L,葡萄糖30.0g L)。
兔血或人血的血浆游离血红蛋白浓度应小于1.0m g mL。
用生理盐水稀释全血至总血红蛋白浓度小于1.250±0.125m g mL。
另外稀释三只兔的等量混合血,混合血的血浆游离血红蛋白和全血的总血红蛋白浓度均应满足上述要求。
取稀释血1 mL,加入3mL D rabk in’s试剂(碳酸氢钠1.0g L,氰化钾0.05g L,铁氰化钾0.2g L)中,测吸光度(OD540)值,即得1mL稀释血中的总血红蛋白。
2.2.3 材料与血液接触 于每种材料6只试管中各加入5mL稀释全血,轻轻混匀。
6只试管分成两组进行静态试验和动态试验。
静态试验组在37±2℃恒温水浴中静置4h,动态试验组在37±2℃的条件下,置振摇板上振摇混合1h,垂直方向不超过45°,振摇频率为30±6r m in。
2.2.4 吸光度的测定 取出上述试管,以700～800g离心5m in,小心吸取上清液1mL,加入3mL D rabk in’s试剂中,在紫外2可见分光光度计(UV2 755B)上,用D rabk in’s试剂调零,测定540nm波长下的吸光度(OD540)值,光径1c m。
查标准曲线,即得游离血红蛋白浓度。
2.2.5 计算溶血指数(H em o lytic index,H.I.)H.I.=1mL上清液中的游离血红蛋白1mL稀释血中的总血红蛋白2.2.6 结果判断 溶血指数为0～2,不溶血;溶血指数为2～10,轻度溶血;溶血指数为10～20,中度溶血;溶血指数为20～40,明显溶血;溶血指数> 40,重度溶血。
2.3 游离血红蛋白直接测定法[11～14]2.3.1 材料的准备 颗粒或砂粒状材料取5g放入一支试管中,洗涤方法同前。
片状材料厚度大于0.5mm取30c m2(单面面积)放入一支试管中。
阴性对照为生理盐水(0.9%N aC l so lu ti on,N S),阳性对照为蒸馏水,各取10mL装入一支试管中。
材料、阴性对照、阳性对照各准备3只试管。
2.3.2 血液的准备 取一只健康家兔的鲜血2 m l,肝素抗凝,加入2.5m l生理盐水稀释,0.2mL 稀释血在10mL蒸馏水中于波长545nm处的吸光度值应为0.8±0.3。
2.3.3 材料与血液相接触 在3只装有样品的试管中每只加入10mL生理盐水,与阴性对照组和阳性对照组同时放入37±2℃恒温水浴中静置30 m in,加入0.2mL稀释血,再在37±2℃恒温水浴中静置1h。
2.3.4 吸光度的测定 取出上述试管,以700～800g离心5m in。
小心吸取上清液4mL,在紫外2可见分光光度计(UV2755B)上,用生理盐水调零,测定545nm波长下的吸光度(OD545)值,光径1c m。
阴性对照组的吸光度的平均值为D nc,阳性对照组的吸光度的平均值为D pc,样品的吸光度为D t。
计算溶血率Z:Z=D t-D ncD pc-D nc×100%2.3.5 结果判断 试验样品的溶血率应小于5%,若大于5%则预示材料有溶血作用。
3 结 果3.1 H i CN法检测羟基磷灰石陶瓷颗粒的溶血指数首先测定了样品在不同兔血中的溶血指数(结果见表1)。
证实不同个体的兔血对试验结果有影响。
211 生物医学工程学杂志 第21卷表1 HA颗粒与不同个体的兔血接触的H i CN法试验结果Table1 The results of HA i n con tact with differen t rabbit blood by H i CN methodM aterials R abbits H emo lytic indexof static testFo r q PH emo lytic indexof static testFo r q PHA8#36.5±7.214.4<0.0168.5±4.554.2<0.01 13#18.7±0.724.3±3.415#42.3±4.165.8±2.4R abbits22.7±1.9 ①与③23.09<0.0155.0±13.3 ①与③10.01<0.01H um an A5.5±0.0 ①与②18.95<0.0111.3±2.0 ①与②8.48<0.01H um an B3.2±0.7 ②与③4.14<0.056.4±1.4 ②与③1.53>0.05A l2O38#2.2±0.65.27<0.055.6±1.10.35>0.0513#1.5±0.04.5±2.615#4.9±0.88.1±1.6N S8#2.2±1.70.25>0.055.0±1.77.22<0.05 13#1.1±0.04.1±0.715#2.4±1.63.2±1.6 注:①、②、③是按三个组的溶血指数的均数从大到小排列,3HA:hydroxyapatite;H i CN:hem iglobincyanide ISO D IS1099324:2000指出,最好选用人血做溶血实验,也可以用三只兔的混合稀释血液代替人血。