综上：酵母双杂交系统通过两个杂交
蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基 因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致
步骤为: 1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵 (bait)，将其与DNA结合域融合，构建成
诱饵质粒。 2、将待筛选蛋白原理用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因
子。研究表明GAL4 的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构
，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)；而转录激活结构域
可与RNA 聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA 聚合酶的活性
。在这一过程中，DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发
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表达载体上,在酵母中表
达两者的融合蛋白。
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如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用，那
么GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激活 结构域就会相互作用，从而激活lacZ报 道基因的表达。所以我们可以通过转化
的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是 否有相互作用。
道株 具有许多优点: 〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。 〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特
征性报道基因。 〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳
动物的蛋白结合
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根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与
已知蛋白质Bait protein的基因构建在 同一个表达载体上，在酵母中表达两者
的BD-Bait protein融合蛋白。将
激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启 动子，使启动子下游基因得到转录。
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酵母双杂交
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酵母双杂交系统的另一个重要的元件
报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)
的重组质粒的宿主细胞。 最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报
基因之间功能相关的主要方法。
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2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是 利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相 互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质 与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应 则可以通过酵母双杂交进行检测。
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在酵母双杂交的基础上，又发展出了 酵 母单杂交、酵母三杂交和酵研究 和两种蛋白相互作用的结构和位点。
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酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展
而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行 检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单 杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、 蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表 达调控。
挥作用。
•
据此，我们可将GAL4 的A结合结构域置换为其他蛋白，只要他
能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活
结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。
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正是基于这一理论，酵母单杂交系游报告基因的报告质粒.
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首先将报告质粒整合入酵母基因组,产生带有目
的对报告基因的表达将蛋白的基因筛选出来.精品课件
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酵母三杂交系统的原理与酵母双杂交相似
，利用了酵母细胞的GAL4蛋白调节目的基因(半乳糖 苷酶基因及His3基因)转录的特点。GAL4蛋白具有两 个可分离的功能区，N端是DNA结合结构域，C端为转 录激活结构域。只要这两个相对独立的结构域能够 通过一定的方式在空间上足够的靠近(如借助其他分 子的相互结合使其足够靠近)，即使它们之间没有共 价结合也可激活转录，这为研究蛋白质与其他分子 的相互作用提供了可能。
酵母双杂交
• 是在真核模式生物酵母中进行的，研究活 细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微 弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的 表达产物敏感地检测得到，它是一种具有 很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术 。
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酵母双杂交系统的建立是基于对真核 生物调控转录起始过程的认识。细胞
起始基因转录需要有反式转录 激活因子的参与
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3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白 质之间相互作用的影响
酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋 白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可 以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗 疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾 病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（ NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETAimportin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术 找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到 相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻 止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。
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这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4， 又不能合成ADE、 HIS 、LEU、TRP，因此，酵母在 缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两 种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重 建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基 因ADE、 HIS、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和 显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株 中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中
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•反式转录激活因子 结构上是
组件式的， 即这些因子往往由两个或
两个以上相互独立的结构域构成， 其
中有DNA结合结构域(DNA binding
domain， 简称为BD)和转录激活结构
域(activation domain， 简称为AD)
。
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• 这两个结合域将它们分开时仍分别具有功 能，但不能激活转录，只有当被分开的两 者通过适当的途径在空间上较为接近时， 才能重新呈现完整的转录因子活性，并可
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3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转 录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能 与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用， 则可激活报告基因的转录；反之，则不能 。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到
新的蛋白质。
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• 酵母双杂交系统的应用
• 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能
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这两个融合蛋白通过第三个融合的RNA分子相连，其一端为 含有噬菌体衣壳蛋白MS2结合位点的MS2RNA，另一端为有待 研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互作用就使得 这个复合物形成一个功能性的转录激活因子，从而使得下 游的LacZ基因和His3基因得以表达。LacZ基因的表达水平 能够通过在体外检测β半乳糖苷酶的活性来确定,His3基因 的表达赋予了酵母细胞在缺乏组氨酸的培养基上生存的能 力。通过缺陷培养基及β半乳糖苷酶的活性的测定就能判 断在酵母菌内是否发生了RNA“X”和蛋白质“Y”的相互作 用。
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上图显示了酵母三杂交系统的原理。在酵母三杂交 •系统，lexA启动子调控下游LacZ基因和His3基因的 表达，而lexA启动子的激活取决于DNA结合结构域 和转录激活结构域能否在空间上相互靠近。
其中第一个融合蛋白由两部分组成，一部分为 能结合lexA启动子的DNA结合结构域，另一部分为 噬菌体衣壳蛋白MS2。第二个融合蛋白也由两部分 组成，一部分为能激活lexA启动子的转录激活结构 域，另一部分为有待研究的RNA结合蛋白“Y”。
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4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图
众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此 协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着 功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多 新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将因之间的联系，建立基因组蛋 白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、 代谢途径等有重要意义
•
当从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-
LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并
对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物
学功能上的联系。
•
另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知