人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定年四季黄黎王栩邬于川袁青(四川省泸州医学院基础医学院,泸州646000)中国图书分类号R392. 11 文献标识码A 文章编号1000 484X( 2010) 06 0544 04[摘要] 目的:构建人源性天然噬菌体展示文库并对文库进行鉴定。
方法: 从未经主动免疫健康志愿者的外周血淋巴细胞中提取总RNA, 反转录合成cDNA, 用直接PCR 及半巢式PCR 扩增人抗体重链( VH)及轻链( V 和V ) 可变区基因。
采用改进的重叠延伸PCR 法将VH 基因和VL( V 和V) 基因连接成人单链抗体( scFv) 基因, 并将scFv 文库基因克隆到噬菌体载体pCANTAB5E中, 电转化E . coli TG1, 构建单链抗体文库。
结果: 采用直接PCR 和半巢式PCR 扩增得到42 条VH 基因片段, 16条V 基因片段, 18条V基因片段。
混合的VH 和VL 等摩尔比连接后, 产生的单链抗体文库基因大小为750 bp 左右; 转化后构建了文库容量为1. 35 108的单链抗体文库。
BstN !酶切分析文库中的单链抗体基因结果显示,酶切得到的scFv 指纹图谱均不相同。
结论:构建的抗体文库多样性好, 可用于多种人源性单链抗体的筛选。
[关键词] 单链抗体;噬菌体抗体文库; 重叠延伸PCRConstruction and identification of nonimmunized human phage display libraryNIAN Si Ji , HU ANG Li , WANG Xu , WU Y uChuan, YU AN Qing. School o f BasicMedical Sciences, Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China[Abstract] Objective:To develop non immunized human phage display library.Methods:The total RNA of lymphocyte cells from peripheral blood of healthy voluntee was isolated and cDNA was synthesized, and the genes of heavy variable chain ( VH) and light variable chain( V and V ) were amplified by direct PCR and half nested PCR. By overlapping extension PCR, the genes of VH and VL( V and V) werelinked. The linked genes of single chain Fv fragment ( scFv) were ligated with the vector pCANTAB 5E and then cloned into TG1 for the scFvlibrary construction. Results:By direct PCR and half nested PCR, 42 VH fragments, 16 V and 18 Vfragmen ts were obtained. The size of linkedscFv library genes was 750 bp and the volume of constructed scFv library was 1. 35 108. The results of BstN ! analysis of scFv genes fromthe phage library showed that fingerprint map of the selected scFvs was different. Conclusion:The developed phage library is diversity and canbe used for selecting humanized scFv.[Key words] Sin gle chain Fv fragment; Phage antibod y library; Overlapping extension PCR目前单克隆抗体( mAb) 作为治疗性抗体发展迅速,主要用于免疫治疗肿瘤、免疫性疾病、器官移植、感染性疾病及心血管疾病等。
但单克隆抗体的临床应用仍然受到一定的限制, 主要障碍是诱导产生的人抗鼠抗体( HAHA) 反应、肿瘤渗入量低及半衰期短的问题[ 1]。
随着基因工程技术的发展, 各种形式的基因工程抗体被构建来改善它们的性能和效能,其中小分子单链抗体( single chain Fv fragment,scFv)可通过噬菌体展示的方法制备, 从而使完全人源化的抗体制备成为可能, 并且单链抗体分子量小,组织穿透力强[ 2]。
噬菌体抗体文库技术的出现是抗体工程领域的重大技术突破。
文库容量和多样性是衡量抗体文库质量的两个重要参数。
文库容量越大, 从中筛选得到抗体的可能性越大, 而且文库容量的大小与所获抗体的亲和力成正比。
在抗体文库的构建过程中,另外一个重要的指标为抗体文库的多样性,文库的多样性可通过设计能扩增所有抗体基因的PCR 引物加以实现。
本研究以未经免疫的健康人外周血为基因来源,以一套被证明能扩增出所有抗体基因的PCR 引物及自行设计的引物扩增获得全套抗体可变区基因,从而构建文库容量大、多样性相对良好的人源性天然噬菌体抗体库,为以后筛选针对各类病毒、毒素、肿瘤特异性抗原及自身免疫疾病相关抗原的特异性人源治疗性单克隆抗体奠定基础。
∀ 544 ∀中国免疫学杂志2010年第26卷1 材料与方法1. 1 实验试剂大肠杆菌TG1、辅助噬菌体M13K07及pCANTAB 5E 噬菌体载体均购自Gene 公司。
淋巴细胞分离液为天根生物技术有限公司产品。
MMLV 反转录酶和RNase inhibi tor 等反转录试剂及PCR 试剂购自Promega公司。
1. 2 引物设计人抗体可变区引物序列是根据文献[35]中的人抗体可变区引物序列重新设计而成(表1) ,重新设计的引物有利于简化抗体基因组装程序,提高组装效率,并且可增加抗体文库的多样性。
1. 3 实验方法1. 3. 1 人淋巴细胞cDNA 的合成抽取60 例未经主动免疫健康人的外周血, 用淋巴细胞分离液常规分离淋巴细胞, 按Trizol 说明书提取淋巴细胞总RNA,以oligo dT 为引物反转录合成第1 链cDNA。
1. 3. 2 VH 和VL 基因的扩增直接PCR 扩增VH 和VL 基因:以第1 链cDNA 为模板, 将VH 基因的上游引物和VH 基因的下游端引物两两配对, 共组成42对引物;将V和V基因的上游引物和下游引物两两配对,分别组成16 对引物和18 对引物, PCR 扩增VH、V和V。
PCR 反应条件为94 # 1 分钟, 55 # 1分钟, 72 # 1 分钟,共30个循环, PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收纯化。
半巢式PCR 扩增VH、V和V基因: 以第一链cDNA 为模板, 将扩增CH 基因的下游引物( CH1R、CH2R 和CH3R) 等摩尔比混合,作为1条下游引物使用,与VH 基因上游引物配对扩增,将扩增得到的PCR 产物纯化并混合作为模板,再以VH 的上游引物与下游引物两两配对, 共组成42 对引物扩增得到VH 基因片段; 同样, 用V 上游引物与半巢式PCR 下游引物CR 扩增cDNA, PCR产物纯化并混合后作为模板, 以V的上游引物与下游引物两两配对, 共组成16 对引物进行扩增得到V基因片段。
用V上游引物与半巢式PCR 下游引物CR 扩增cDNA, PCR 产物纯化并混合后作为模板,以V的上游引物与下游引物两两配对, 共组成18 对引物进行扩增得到V基因片段。
第1 轮半巢式PCR条件为: 94 # 1 分钟, 50 # 1 分钟, 72 # 1 分钟,共30 个循环。
第2 轮PCR 的条件为: 94 # 1 分钟, 55 # 1分钟, 72 # 1 分钟,共30 个循环。
PCR 产物经琼脂糖凝胶鉴定后回收纯化。
1. 3. 3 scFv 基因的拼接将所有回收的VH 基因片段混合即得到VH 基因文库;同样将回收的V基因片段混合得到V 基因文库;将回收的V基因片段混合得到V基因文库,将VH 基因库以VHscFvF 为上游引物,以linkerR为下游引物,进行PCR 扩增,获得VHlinker 基因片段; 将V 基因文库以上游引物linkerF 和下游引物VscFvR 为引物, 进行PCR 扩增,获得linkerV基因片段;将V基因文库以linkerF和V sc FvR 为引物, 分别进行PCR 扩增, 获得linkerV基因片段。
PCR 反应条件为94 # 1 分钟, 55 # 1 分钟, 72 # 1分钟, 共30 个循环。
PCR 产物均经琼脂糖凝胶电泳,切胶回收目的片段。
表1 构建天然人源scFv文库的引物Tab. 1 Oligonucleot ide primers for construction of non immu nized human scFv libraryVH f orward primers:5 ∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCSG3 ∃5 ∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA 3 ∃5 ∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGG 3 ∃5 ∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGKTGGAGWCY 3 ∃5 ∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTCCAGCTKGTRCAGTCTGG 3 ∃5 ∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGRTCACCTTGAAGGAGTCTG 3 ∃5 ∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGGTGSARTCTGG3 ∃VH reverse primers:5 ∃ TCCGCCGAGACCGCCTCCACCTGAGGAGACRGTGACCAGGGTG 3 ∃5 ∃ TCCGCCGAGACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTT 3 ∃5 ∃ TCCGCCGAGACCGCCTCCACCTGAAGAGACGGTGACCATTGT 3 ∃5 ∃ TCCGCCGAGACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC3∃5 ∃ TCCGCCGAGACCGCCTCCACCGGTTGGGGCGGATGCACTCC3 ∃5 ∃ TCCGCCGAGACCGCCTCCACCSGATGGGCCCTTGGTGGARGC3 ∃Vforward primers:5 ∃GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGGACATCCRGDTGACCCAGTC TCC 3 ∃5 ∃GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGGAAA TTGTRW TGACRCAGTCTCC 3 ∃5 ∃GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGGAT A TTGTGMTGACBCAGWC TCC 3 ∃5 ∃GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGGAAACGACAC TCACGCAGTCTC 3 ∃Vbackward primers:5 ∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTTGGTCC3∃5 ∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCASCTTGGTCC3 ∃5 ∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTTGGTCC 3∃5 ∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCC3 ∃Vforward primers:5 ∃GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGCAGTCTGTSBTGACGCAGCCGCC 3 ∃5 ∃GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGTCCT ATGWGCTGACWCAGCCAC 3 ∃5 ∃GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGTCCT ATGAGCTGAYRCAGCYACC 3 ∃5 ∃GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGCAGCCTGTGCTGACTCARYC 3 ∃5 ∃GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGCAGDCTGTGGTGACYCAGGAGCC 3 ∃5 ∃GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGCAGCCWGKGCTGAC TC AGCC MCC 3 ∃5 ∃GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGTCCTCTGAGCTGASTCAGGASCC 3 ∃5 ∃GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGCAGTCTGYYCTGAYTCAGCCT 3 ∃5 ∃GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGAATT TT ATGC TGACTCAGCCCC 3 ∃Vbackward primers:5 ∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACCTAGGACGGTSASCTTGGTCC3 ∃5 ∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC3 ∃CH1R: 5 ∃ GGATCCTCTAGATTTACCCGGAGACAGG 3 ∃CH2R: 5 ∃ TCTATCCACGAGGGTCC3∃CH3R: 5 ∃ CTCTCTTGTCCACCTTGT3∃CR: 5 ∃ GGATCCTCTAGAACACTCTCCCCTGTTG 3 ∃CR: 5 ∃ CATTCATGAGACACACCT 3 ∃VHsc FvF: 5 ∃ATCGACGCTACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGT 3 ∃V sFvR:ACGGCTGCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTT3 ∃V sFvR:ACGGCTGCGTCAGAGTGCGGCCGCACC 3 ∃.L inke rF: 5 ∃TC AGGTG GAGGCGGT TC TGGC GGAGGT GGC TC AGGCGG TGGAGGC TCG3 ∃Li nkerR:5 ∃ CGAGCC TCCACC GCC TGAGCCACC TCC GC CAGAACC GC CTC CACC TGA5 ∃∀ 545 ∀年四季等人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定第6 期混合linkerV和linker V得到linker VL 基因片段。