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显微镜的七种观察方法

视野亮度高、均匀, 应用范围广, 操作简单,价格低, 物镜适用于荧光观察 缺点: 透明标本对比度低, 标本没有立体感
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按观察方法分 7-2
2.暗场:照明光通过物镜外
围射于试样,来自试样的干涉及 衍射光进入物镜并最终被观察到。
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暗场
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1 原理 丁道尔(Tyndall)现象,微粒对斜射光反射或衍射,增 大了人眼可见性。 2 特点 观察到极其微小物体,分辨率可达0.02 ~ 0.004 um (明场0.4um)—”超显微“。 3 缺点 只能观察到物体存在、运动和外部形态 不方便调节 标本要求高(灰尘、盖片、载片)
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使用抗衰减剂的效果
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汞灯灯箱构造
灯室,上下、左右旋钮,聚光镜旋钮
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按观察方法分 7-4
4.偏光:有些物质在两个呈
一定夹角的偏光滤片之间可现呈 鲜明的对比,或根据双折射性能 和定向呈现颜色
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偏光
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1 原理
依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以 此判别物质结构的一种显微镜
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4 应用: 微小粒子、细菌形态观察 、细菌记数,透明标本观 察等
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按观察方法分 7-3
3.荧光:利用某些物质在受
到了紫外光或短波长的光激发照 射以后能够发射出比激发光波长 长的荧光的特性的观察方法
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荧光
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什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变 为高能状态,再回到低能状态时释放出的光,是 非温度辐射光——冷光。即:物质吸收短波光, 发射出的长波光。
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按观察方法分 7-7
7.霍夫曼:光线穿过设于聚光
镜内的狭缝光阑后并经“相位物体” (透明体)折射,再经过专用物镜 内的具有暗、灰、明三个区的一块 滤光片,而最终使光线按折射角的 不同呈明暗的变化,其所成的像也 类似DIC那样具有浮雕效果。
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霍夫曼
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1 原理 斜射光照射到标本产生折射、衍射,光 线通过物镜光密度梯度调节器产生不同 阴影,从而使透明标本表面产生明暗差 异,增加观察对比度。
共轭面:吸收光线,直射光通过 补偿面:相位推迟,衍射光通过
物镜相 板
聚光镜环状光阑经济的方法 3 缺点 需要光强高 切片不能太厚(5~10um) 盖片、载片需符合标准 最好配用单色滤光镜 操作较麻烦 荧光效果不如明场物镜
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4 应用: 无色透明活体标本的细微结构,检查,鉴定活体细胞 (培养细胞,分离细胞)

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显微镜的七种观察方 法
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按观察方法分七种
明场
DIC 暗场
荧光
偏光
霍夫曼 相差
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显微观察方式
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按观察方法分 7-1
1.明场:照明光直接通过聚
光镜入射于试样,并透过试样后 进入物镜并最终被观察到。
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明场
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明场观察方式
常规观察方式 应用领域:
常规镜检、病理、染色标本 优点:
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2 特点 可以使被检物体产生三维立体感觉 观察效果更直观 无须特殊物镜,与荧光观察配合更好 可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的 效果。
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3 缺点 需要光强高,双折射物质不能达到DIC镜检效果,不能应用于塑料容器培养 物的观察,镜检灵敏度有方向性,调节较复杂
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4 应用: 无色透明活体标本的细微结构,无色荧光标本, 染色标本,显微操作等
透射式
落射式
❖ 汞灯光源 ❖ 激发滤色镜 ❖ 吸收滤色镜 ❖ 暗场聚光镜
❖ 汞灯光源 ❖ 激发滤色镜 ❖ 分色镜 ❖ 吸收滤色镜
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落射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 激发滤色镜
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落射荧光显微镜的构造
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荧光显微镜光源
• 汞灯光源:
提供激发光(U、V、B、G)
• 氙灯光源:
高峰值更宽,更稳定
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4. 缺点 观察效果与标本方向密切相关 操作较复杂 必须有多元件,结构复杂的高数值孔径RC物镜 观察荧光效果不如明场物镜
5. 应用 所有类型的细胞,组织(无论活体,染色,未
染色),晶体表面细节,透明聚合物,玻璃 和其它类似材料,尤其适用于显微操作
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<B 阻挡
>B 透过
精品课件 A
B
nm
落射荧光显微镜各部件特性和 作用
分色镜: 反射激发光,荧光透过
T%
<A 反射
>A 透过
吸收滤色镜: 荧光透过,阻挡杂光
A
nm
T%
>B ,<C 透过
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AB
C
nm
滤色镜的选择
荧光素的特性
荧光素
激发波长 发射波长
DAPI
372
456
AMCA
350
450
Hoechst 33258
WIB: BP460-490
NB: BP470-490
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多重染色标本的多色观察
FITC+Texas Red+DAPI
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三色滤色镜的特性曲线
激发
分色
吸收
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双重染色标本的单色和双色观 察
WU
WIB
DUAL BAND
DAPI+FITC
WIBA
WIG
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WIB
FITC+PI
单色滤色镜的特性曲线
365
465
FITC
490
520
Acridine Orange
490
590
Acridine Yellow
470
550
CY3
552
565
TRITC
541
572精品课件
Propidium Iodide 530
615
滤色镜的特性
激发
分色
吸收
FITC+PI
带宽对图象的影响
SWB: BP420-480
WB: BP450-480
5.相衬(差):利用光线通
过分别处于聚光镜与物镜的一对互
补的光环后产生干涉(强度叠加或
减弱),即相位差转变成了光强差,
从而可清楚观察到使原来不易看清
的透明类样品(即相位物体,如活
细胞)。
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相 差(衬)
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相 差(衬)
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1 原理
利用被检物体的光程(折射率 x 厚度)差进行镜检,即利用干涉现象,将相位 差变为人眼可以分辨的振幅差
优点:
❖ 检出能力高(放大作用) ❖ 对细胞的刺激小(可以活体染色) ❖ 能进行多重染色 用途: ❖ 物体构造的观察——荧光素 ❖ 荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体
荧光等 ❖ 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
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荧光显微镜的种类
透射式
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荧光显微镜的种类
落射式
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荧光显微镜的主要部件
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❖ 偏光显微镜主要用于检测矿石,地质大学会用 到,特别是可以用来鉴定珠宝,另外可以检测 生物内骨骼,这个我还没有遇见实例,还可以 检测生物化学结晶,化学院用来观察结晶液像 ,其他在纺织物品化学成分上检测上,物理芯 片上等,凡是观察双折射晶体会使用偏光显微 镜。
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按观察方法分 7-5
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荧光显微镜激发透镜组
• 激发透镜组
吸收 滤色镜
(激发块):
激发 滤色镜
发射光
入射光
• 激发滤色镜:
激发波长选择
分光 滤色镜
T%
nm 精品课件
BAND PASS
落射荧光显微镜各部件特性和 作用
• 分色镜:
T%
反射激发光,荧光透过 <A 反射
>A 透过
A
nm
• 吸收滤色镜:
T%
荧光透过,阻挡杂光
显微镜荧光利用光源激发——光化荧光
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荧光的种类
自发(固有)荧光 二次荧光
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荧光的性质
❖ 吸收光,必需有激发光源 ❖ 荧光波长>激发波长(损失热能) ❖ 荧光强度极小于激发光的强度 ❖ 有不同程度的衰减 ❖ 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、
荧光效率
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荧光显微镜的优点和用途
偏振器1
自然光(多 振动面)
偏振器2
偏振光(单 一振动面)
各向同性:单折射体,光性质不因照射方向而改变,普 通气体、液体、非结晶固体等
各向异性:双折射体,光速度、折射率、吸收和振动面、
振幅随照射方向不同,晶体、纤维等
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应用: 矿物质、化学物品鉴别 鉴别纤维、染色体、淀粉粒、细胞中晶体 植物病理检验 鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿 瘤细胞、横纹肌和毛发等
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双色滤色镜的特性曲线
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现行显微镜特点和各种滤色镜
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分色镜
自由组合 激发块
吸收滤色镜
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激发滤色镜
油 镜 应 使 用 荧 光 油
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物镜光栏的运用 减少杂散光干扰
光栏全开启
光栏适当关小
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荧光的衰减
有衰减的标本
防衰减的方法
❖ 使用抗衰减剂 ❖ 选择衰减小的荧光素 ❖ 降低激发光强度 ❖ 降低标本中氧的浓度
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2. 历史 1975年,Robert Hoffman 博士发明 2002年,专利到期,各显微镜厂家纷纷推出采用以自己
名义命名的RC技术产品
3. 特点 提高未染色标本的可见性和对比度; 图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕; 可检测双折射物质(岩石切片、水晶、骨头) ; 可检测玻璃,塑料等培养皿中的细胞,器官和组织; 聚光镜的工作距离可以设计的更长; RC物镜也可用于明场,暗场和荧光观察
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