试剂配制方法一、实验室常用储备液(1)0.5mol/L EDTA(乙二胺四乙酸)在700ml 超纯水中溶解186.1g Na2EDT A·2H2O,在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
用10mol/L NaOH调至PH8.0(约用10mol/L NaOH 50ml),补加超纯水至1L。
分装后高压蒸汽灭菌。
室温贮存。
注意:EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的PH值调至接近8.0,才会溶解。
(2)1mol/L Tri s·Cl将121.1g Tris碱溶于800ml超纯水中,用浓盐酸将PH值调至设定值。
PH值HCl7.4 70ml7.6 60ml8.0 42ml应使溶液冷却至室温后,方可最后调定PH值。
加超纯水定容至1L,分装后高压蒸汽灭菌。
如果配制的溶液呈现黄色,应予丢弃。
并使用质量更好的Tris。
Tris溶液的PH值因温度而异,温度每升高1℃,PH值大约降低0.03个单位。
(3)10mol/L 乙酸铵(NH4C2H3O2)将771g乙酸铵溶于800ml蒸馏水中,磁力搅拌至完全溶解,用蒸馏水定容至1L,过滤除菌,室温贮存。
乙酸铵在热水中分解,含有乙酸铵的溶液不能高压蒸汽灭菌。
(4)甘油(10%,V/V)用9体积的灭菌纯水稀释1体积的分子生物学级的甘油。
用0.22μm过滤器过滤除菌。
分装成1ml每份,-20℃贮存。
(5) 10mg/ml溴化乙啶(EtBr)在20ml双蒸水中溶解0.2g溴化乙啶,磁力搅拌数小时,以确保其完全溶解。
然后用铝箔包裹容器或将溶液转移至棕色瓶中,于4℃避光保存。
注意:溴化乙啶是一种诱变剂,必须小心操作。
(6) 70%乙醇(C2H5OH)100ml70ml无水乙醇溶于30ml蒸馏水。
(7) 50×葡萄糖Glucose(150ml储备液)将54g D-葡萄糖溶于超纯水,磁力搅拌至完全溶解,并将体积调至150ml,过滤除菌,室温贮存。
(8) 10mol/L氢氧化钠(NaOH)将400g NaOH颗粒,加入到一个约含有0.9L蒸馏水的烧杯中,磁力搅拌至完全溶解。
不要向NaOH颗粒中加水。
烧杯可置于冰浴中,当颗粒完全溶解后,加蒸馏水至1L。
注意:NaOH溶液的制备属于放热反应,液体制备要极为谨慎,预防玻璃器皿破碎和化学灼伤。
如有条件,可使用厚的塑料烧杯。
(9) 3mol/L乙酸钠(PH5.2和PH7.0)将408.1g乙酸钠·3H2O(M=136g/mol)溶于800ml蒸馏水中,加冰醋酸将PH值调至5.2,或用稀乙酸将PH值调至7.0,加蒸馏水定容至1L,等份分装,高压除菌,室温贮存。
(10)5mol/L NaCl将292.2g NaCl溶于约800ml蒸馏水中,磁力搅拌至完全溶解,定容至1L。
等份分装,高压除菌,室温贮存。
(11)1mol/L CaCl2147g CaCl2·2H2O溶于约800ml蒸馏水中,磁力搅拌至完全溶解,加蒸馏水至1L。
4℃贮存。
(12)1mol/L KCl74.6g KCl溶于约800ml蒸馏水中,磁力搅拌至完全溶解,加蒸馏水定容至1L。
高压蒸汽灭菌20min,室温贮存。
理想的做法是将配好的溶液分装在灭菌管内,每小份约100μl,每份只使用一次。
(13)1mol/L MgCl220.3g MgCl2·6H2O,加水定容至100ml。
室温贮存。
(14)1mol/L HCl按以下顺序混合:913.8ml H2O,86.2浓盐酸。
室温保存。
(15)1mol/L MgSO424.6g MgSO4·7H2O,加水定容至100ml。
室温保存。
(16)1mol/L MnCl2MnCl2的分子量为197.0。
将197g MnCl2溶于约800ml蒸馏水中,磁力搅拌至完全溶解,蒸馏水定容至1L,室温贮存。
(17)1mol/L碳酸氢钠将12.6g碳酸氢钠(M=84)溶于100ml蒸馏水中,体积调至150ml,即可获得1mol/L溶液,过滤除菌,室温贮存。
(18)1mol/L乙酸钾(KOAc,PH7.5)将9.82gKOAc(M=98.14g/mol)溶于90ml超纯水中,用2mol/L乙酸将PH 调至7.5,加纯水至100ml,将溶液等份分装,-20℃贮存。
(19)8mol/L乙酸钾将78.5g乙酸钾溶于80ml超纯水中,再将溶液体积调至100ml,经0.22μm过滤器除菌,室温贮存(时间不限)。
(20)10mol/L氯化锂(LiCl)无水氯化锂分子量为42.4,取424g无水氯化锂溶于1L蒸馏水中配成10mol/L的溶液,高压除菌,室温贮存。
氯化锂的一水合物易潮解,一般不用。
(21)1mol/L乙酸镁将214.46g乙酸镁·4H2O溶于800ml蒸馏水中,加蒸馏水将体积调至1L,高压除菌,室温贮存。
二、实验室常用缓冲液(1)50×TAE电泳缓冲液(1L)试剂用量Tris碱242g冰醋酸57.1mlNa2EDT A·2H2O 37.2g加蒸馏水定容至1L(2)10×TBE电泳缓冲液(1L)试剂用量Tris碱108g硼酸55g0.5mol/L EDTA(PH8.0) 40ml加超纯水定容至1L(3)10×TPE缓冲液试剂用量Tris碱108g85%磷酸(1.679g/ml) 15.5ml0.5mol/L EDTA(PH8.0) 40ml加超纯水定容至1L(4)1mol/L磷酸钠缓冲液(PH6.0-7.2)(1L)将1mol/L NaH2PO4(单盐)和1mol/L Na2HPO4(二盐)储备液按下表说明混合,可得到所需的不同PH值的1mol/L磷酸钠缓冲液1L。
配制1mol/L储备液:将138g NaH2PO4·H2O(M=138g/mol)溶于足量蒸馏水制成1L溶液;将142g Na2HPO4(无水,M=142g/mol)溶于足量蒸馏水配成1L溶液。
1mol/L NaH2PO4的体积(ml)1mol/L Na2HPO4的体积(ml)最终PH值877 123 6.0850 150 6.1815 185 6.2775 225 6.3735 265 6.4685 315 6.5625 375 6.6565 435 6.7510 490 6.8450 550 6.9390 610 7.0330 670 7.1280 720 7.2 (5)0.1mol/L磷酸钠缓冲液(由1mol/L储备液制得)(25℃)(100ml)1mol/L Na2HPO4的体积(ml)1mol/L NaH2PO4的体积(ml)最终PH值7.9 92.1 5.812.0 88.0 6.017.8 82.2 6.225.5 74.5 6.435.2 64.8 6.646.3 53.7 6.857.7 42.3 7.068.4 31.6 7.277.4 22.6 7.484.5 15.5 7.689.6 10.4 7.893.2 6.8 8.0 (6)10×TE(1L)试剂用量1mol/L Tri s·Cl(PH8.0)100ml0.5mol/L EDTA 20ml加蒸馏水至1L(7)1×TE(100ml)试剂用量1mol/L Tri s·Cl(PH8.0)1ml0.5mol/L EDTA 200μl加蒸馏水至100ml三、核酸提取及纯化试剂(1) 2%CTAB(100ml)试剂终浓度用量1M Tris-HCL(PH8.0)100mM 10ml0.5M EDTA(PH8.0)20mM 4mlCTAB 3%(g/100ml) 2gPVP 2%(g/100ml) 2g5M NaCl 1.4M 28ml蒸馏水定容至100ml(2) 3%CTAB(100ml)试剂终浓度用量1M Tris-HCL(PH8.0)100mM 10ml0.5M EDTA(PH8.0)20mM 4mlCTAB 3%(g/100ml) 3gPVP 2%(g/100ml) 2g5M NaCl 1.4M 28ml蒸馏水定容至100ml(3) 10%CTAB(50ml)试剂终浓度用量5M NaCl 0.7M 7mlCTAB 10%(g/100ml) 5g蒸馏水定容至50ml(4)总RNA提取的变性裂解液(250ml)试剂用量0.78M柠檬酸钠8.25ml10%肌氨酸钠12.375ml异硫氰酸胍118.05gDEPC水定容至250ml(5)0.1%DEPC水在1L超纯水中加入1ml DEPC,制成最终浓度为0.1%(v/v)的溶液,摇晃至DEPC充分扩散,于37℃孵育12h,高压除菌20min,使多余的DEPC失活。
(6) 8%SDS(十二烷基硫酸钠)20g SDS溶解于90ml蒸馏水,用浓盐酸调节PH值至7.2,蒸馏水定容至250ml,室温保存。
每次只加入几克SDS,可使溶液制备更容易。
(7)氯仿:异戊醇(24:1)按照24:1的比例配制混合溶液,4℃避光保存。
其中氯仿可使蛋白质变性并有助于水相和有机相的分离,异戊醇则有助于减少抽提过程中泡沫的形成。
无论是氯仿还是异戊醇,使用前均无须处理。
(8)叶绿体、线粒体匀浆缓冲液(1L)试剂用量终浓度蔗糖 102.687g 0.3mol/L1M Tris-HCl 50ml 50mmol/L 0.5M EDTA 10ml 5mmol/L BSA 1g 0.1% PVP10g1% 1mol/L MgCl 2 10ml 10mmol/L Vc1g0.1% β-巯基乙醇 1ml 0.1%蒸馏水定容至1L(9) 叶绿体、线粒体保存缓冲液(1L )试剂 用量终浓度蔗糖 102.687g 0.3mol/L 1M Tris-HCl50ml50mmol/L 10mmol/L MgCl 2 10ml 10mmol/L蒸馏水定容至1L(10) 叶绿体、线粒体裂解缓冲液(100ml )(11) 叶绿体高盐缓冲液(500ml )试剂用量 终浓度1M Tris-HCl 25ml 50mmol/L试剂用量终浓度1M Tris-HCl 5ml 50mmol/L 0.5M EDTA5ml 25 mmol/L蒸馏水定容至100ml0.5M EDTA 25ml 25 mmo1/L5M NaCl 125ml 1.25 mol/LBSA 0.5g 0.1%β-巯基乙醇0.5ml 0.1%蒸馏水定容至500ml(12)线粒体冲洗缓冲液(1L)试剂用量终浓度NaCl 8.775g 0.15mmol/L1M Tris-HCl 50ml 50mmol/L(PH8.0)0.5M EDTA 50ml 25 mmo1/L蒸馏水定容至1L四、DNA、RNA和蛋白质电泳试剂(1)40%丙烯酰胺(500ml)4℃避光保存试剂用量丙烯酰胺(Acry) 190g甲叉双丙烯酰胺(bis) 10g超纯水定容至500ml(2)6%丙烯酰胺(1L)4℃避光保存试剂用量尿素450g40%丙烯酰胺胶150ml10×TBE 100ml超纯水定容至1L附:聚丙烯酰胺分离DNA的有效范围丙烯酰胺%(w/v)有效分离范围bp 二甲苯氰* 溴酚蓝*3.5 1000~2000 460 100 5.0 80~500 260 65 8.0 60~400 160 45 12.0 40~200 70 20 15.0 25~150 60 15 20.06~1004512*所给数据是有染料迁移的双链DNA 片段的近似大小(3) 变性上样缓冲液(20ml )4℃保存试剂用量 终浓度 98%去离子甲酰胺 19.6ml 10mM EDTA 0.4ml溴酚蓝 0.05g 0.25% 二甲苯氰 0.05g0.25%(4) 亲和硅烷(100ml )4℃保存(5) 10%过硫酸氨(APS )1g 过硫酸氨加超纯水至10ml ,该溶液可在4℃条件下贮存数周。