一. 土壤样品的采集第一种: 选择植被群落具有代表性的固定样方,除去地面植被和地表覆盖物,每样方采用土壤剖面法和多点混合取样法采样,将土样混匀,用四分法弃去多余样品,取500g装入灭菌信封, 带回实验室后立即进行土壤微生物分离（4℃保存）、计数。

第二种: 在小区内机械抽取 6 株样木，距树干基部0.5 m 呈梅花形分布挖取根系周围0～20 cm、20～40 cm 和40～60 cm 土样，分层充分混合后作为非根际土壤样品。

同时采集各层直径小于0.2～0.5 cm 细根上粘附的土壤，分层充分混合作为根际土壤。

供微生物分析的鲜土样装入已消毒过的密封塑料袋，带入实验室。

二. 三大类土壤微生物分离与数量测定1. 细菌的分离与数量测定(1)以平板表面涂抹法计数。

称取土壤鲜样10g在无菌条件下用无菌水配成不同浓度梯度悬浮液，取稀释度为10-3，10-4，10-5，10-6，10-7土壤悬浮液各50μL，接种于盛有灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的培养皿中,用无菌刮刀涂抹均匀。

每个浓度3个重复，恒温(28 ℃) 培养3d，选取每皿菌落数为15-150的1个稀释度统计菌落数，按下列公式计算细菌数量：菌数(cfu/ g) = （菌落平均数×稀释倍数）÷干土% （Ⅰ）牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，配方如下：牛肉膏3.0 g 琼脂18 g 蛋白胨5.0 g 蒸馏水1000mL pH7.0 —7.2 2. 真菌的分离与数量测定以平板表面涂抹法计数。

即称取土壤鲜样10 g ,在无菌条件下用无菌水配成不同浓度梯度悬浮液,取稀释度为10-2，10-3，10-4的土壤悬浮液各50μL，接种于盛有灭菌的马丁- 孟加拉红培养基的培养皿中,用无菌刮刀涂抹均匀。

每个浓度3个重复,恒温(25 ℃) 培养5～7 d，选取每皿菌落数为15～150 的1个稀释度统计菌落数计算真菌数量公式同公式（Ⅰ）。

马丁- 孟加拉红培养基，配方如下：葡萄糖10.0 g MgSO4.7H2O 1.0 g KH2PO4 1.0 g 琼脂15 g 蛋白胨 5.0 g 孟加拉红(Rose Bangal) 每升加1%溶液0.33mL 1% 链霉素3 mL 蒸馏水1000 mL pH自然临用前再加入1% 链霉素3 mL3. 放线菌数量测定以平板表面涂抹法计数。

除取稀释度为10–3，10–4，10-5的土壤悬浮液各50μl接种于盛有灭菌的改良高氏一号培养基外，其余与细菌数量测定方法相同。

恒温(28℃) 培养7～10 d，按上述方法和公式统计菌落数并计算细菌数量。

培养基改良高氏一号培养基，配方如下：可溶性淀粉20g KNO3 1.0g FeSO4.7H2O 0.01g K2HPO4 0.5g MgSO47H2O 0.5g NaCl 0.5 g 琼脂18 g K2Cr2O40.01 g 蒸馏水1000 ml pH7.2 ～7.4临用时加10%重铬酸钾1ml/300ml, 抑制细菌生长二.土壤各类微生物生理群落数量测定1. 好气性纤维素分解菌数量测定好气性纤维素分解菌数量测定采用平板表面涂抹法计数。

在灭菌的盛有赫奇逊氏培养基的培养皿中放一块直径与培养皿等大的灭菌无淀粉滤纸(事先用1%稀醋酸浸泡一昼夜，并用2%的苏打水洗到中性)，用干净、灭菌的玻璃刮刀压平。

取稀释度为10-2，10-3，10-4的土壤悬浮液各50ｕl，接种于附有滤纸的培养基中，用无菌刮刀涂抹均匀。

每个浓度3个重复，恒温(28℃)培养14d-18d，按上述方法和公式(Ⅰ)统计菌落数，计算每g干土中的菌数。

培养基配方如下:羧甲基纤维素纳10g (NH4)2SO40.5 g KH2PO4 1.0 g CaCl20.1 g MgSO40.2 g 琼脂20 g 蒸馏水1000 ml pH7.2—7.3 培养基采用赫奇逊( Hutchinson )氏培养基，配方如下:KH2PO41.0 g NaNO32.5 g NaCl 0.1 g CaCl20.1 g 琼脂20 g MgSO4. 7H20 0.3 g FeCl3 0.01 g 蒸馏水1000 ml pH7.2—7.3 2. 嫌气性纤维素分解菌数量测定嫌气性纤维素分解菌数量测定采用稀释法。

分别将15 ml培养基分装于试管中(深层造成嫌气条件)。

各管插入1条1cm×10cm滤纸条，一个大气压灭菌30min。

将稀释浓度为10-2，10-3，10-4，10-5的土壤悬液1 ml接入试管，每稀释度重复3次。

另取3支试管接种lml无菌水作对照，于28 —30℃培养14d—18d，取出检查滤纸上的溶解区或纸屑的腐烂情况，并观察滤纸条上是否出现菌落，以判断嫌气性纤维素分解菌的生长。

若在滤纸上生长，则常缀上黄色、褐色或黑色的斑点。

滤纸条一摇动立即破裂。

根据检查得出数量指标，然后根据数量指标查Mecrady表，得出菌数近似数，按公式(2)计算出每g干土中嫌气性纤维素分解菌的数量。

培养基采用奥曼粱斯基培养基，配方如下:(NH4)2SO4 1.0g K2HPO4 1.0g MgSO4.7H2O 0.5g NaCl 0.2g CaCO3 2.0g 蒸馏水1000m13. 自生固氮菌数量测定好气性自生固氮菌数量测定采用平板表面涂抹法计数。

除恒温(28℃)培养7d——l0d外，与真菌分离及其数量测定方法相同。

(除取稀释度为10–3，10–4，10-5的土壤悬浮液各50μl接种于盛有灭菌的改良高氏一号培养基外)培养基采用改良阿须贝(Ashby)无氮琼脂培养基，配方如下：葡萄糖l0.0g K2HPO40.2g K2SO40.2g NaCl 0.2g CaCO3 5g MgSO4.7H2O 0.2 g 琼脂18.0 g 蒸馏水1000 ml 4. 反硝化细菌数量测定采用稀释法。

分别将15 ml 培养基分装于试管中（造成嫌气条件）。

一个大气压灭菌20min。

将稀释度10–2，10–3，10–4，10–5，10–6的土壤悬浮液1 ml接入试管，每稀释度重复3 次。

领取试管接种1ml 无菌水作对照，与28-30℃培养14d，检查有无细菌生长，如有菌生长，一般有气泡出现，培养液浑浊。

同时使用奈氏试剂检查是否有氨产生（加入奈氏试剂，若有氨产生，则由黄色或褐色沉淀出现）。

再用格利斯试剂检查是否有NO2-出现（加入格利斯试剂，若有NO2-出现，则呈红色），并用二苯胺试剂检查是否有NO3-出现（加入二苯胺试剂，若有NO3-出现，则呈蓝色）。

根据检查得出数量指标，然后根据最大然或法查Mecrady 表，得出菌数近似数，计算公式同公式（Ⅰ）。

培养基采用组合培养基，配方如下：蛋白胨20.0g 葡萄糖1.0g NaHPO4 2.0g KNO3 1.0g 琼脂1.0g 蒸馏水1000ml三氮显色试剂配制与使用（氨氮、亚硝态氮和硝态氮）奈氏试剂的配制：将10g碘化汞和7g碘化钾溶于10ml水中，另将24.4g氢氧化钾溶于内有70ml水的100ml容量瓶中，并冷却至室温。

将上述碘化汞和碘化钾溶液慢慢注入容量瓶中，边加边摇动。

加水至刻度，摇匀，放置2天后使用。

试剂应保存在棕色玻璃瓶中，置暗处。

向培养液中加入奈氏试剂：如有氨氮存在（氨化细菌）将产生棕黄色络合物沉淀。

格里斯氏(Griess)试剂：A 液：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸(10%左右)150mLB 液：α萘胺0.1g，蒸馏水20mL, 稀醋酸(10%左右)150mL二苯胺试剂：二苯胺0.5g 溶于l00mL 浓硫酸中，用20mL 蒸馏水稀释。

在培养液液中滴加A、B 液后溶液如变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色等表示有亚硝酸盐（亚硝化细菌阳性）。

先加入格里斯A液，完全去除亚硝态氮（也可直接加入醋酸和对氨基苯磺酸），然后加1～2 滴二苯胺试剂；如溶液呈蓝色则表示培养液中存在有硝酸盐（硝化细菌阳性）。

5. 硝化细菌数量测定采用稀释法。

除只用格利斯试剂检查否有NO2-出现（加入格利斯试剂，若有NO2-出现，则呈红色）外，其余与反硝化细菌数量测定方法相同。

培养基采用改良斯蒂芬逊培养基, 配方如下：（NH4）2SO4 2.0g MnSO44H2O 0.01g NaHPO40.25g MgSO4 7H2O 0.03 g CaCO30.5g K2HPO40.75g 蒸馏水1000ml 6. 氨化细菌数量测定(还不确定)采用牛肉膏蛋白胨培养基测定调节PH7.2～7.4，121℃高压灭菌30min.将接种后的蛋白胨氨化培养基在25～28℃培养箱中培养2天，用或然记数法测定。

操作步骤（1）取牛肉膏蛋白胨液体培养基四支，分别接种土壤颗粒，大肠杆菌、枯草杆菌，余下一支不接种作为空白对照，在每支试管口悬挂一经无菌水湿润的石蕊试纸，并加好试管塞。

（2）将已经接种的培养管置于28--30℃培养5--7日。

（3）结果检测：观察各管石蕊试纸变色及培养液浑浊情况，用奈氏试剂检测是否有氨产生。

最大或然数表MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如lm1）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。

根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。

具体地说，菌液经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜的液体培养基中。

培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表（见附录九）上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。

如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；稀释度10-310-410-5 l0-610-710-8重复数 5 5 5 5 5 5出现生长的管数 5 5 5 4 1 0根据以上结果，在接种l0-3—10-5稀释液的试管中5个重复都有生长，在接种l0-6稀释液的试管中有4个重复生长，在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长，而接种10-8稀释液的试管全无生长。

由此可得出其数量指标为“541”，查最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数的稀释倍数（10-5的稀释倍数为100 000）。

那么，1ml 原菌液中的活菌数＝17×100 000 = 17×105。

即每毫升原菌液含活菌数为l700000个。

在确定数量指标时，不管重复次数如何，都是3位数字，第一位数字必须是所有试管都生长微生物的某一稀释度的培养试管，后两位数字依次为以下两个稀释度的生长管数，如果再往下的稀释仍有生长管数，则可将此数加到前面相邻的第三位数上即可。

如某一微生物生理群稀释培养记录为：稀释度l0-110-2 10-3l0-410-510-6重复数 4 4 4 4 4 4出现生长的管数 4 4 3 2 1 0以上情况，可将最后一个数字加到前一个数字上，即数量指标为“433”，查表得近似值为30，则每毫升原菌液中含活菌30×102个。