GFP
1，GFP的发现 GFP是从一种生活在北太平洋寒冷水域的 水母体内发现的。这种水母体内含有一种 生物发光蛋白质——aequorin，它本身发 蓝光。GFP能把这种光转变成绿色，也就 是当水母容光焕发的时候我们实际看到的 颜色。受到Ca2+或紫外线激活时, 水母中 的发光蛋白Aequorin 被激活, 产生蓝光, GFP 能够吸收蓝光( 395nm 处有最大光 吸收) , 发射绿色( 或黄绿色) 荧光
Monday, May 13, 2019
蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝 色），子链的一部分直接从中间穿过 （绿色），发色团刚好在罐头盒的中 间，它被保护起来以免受周围环境的 影响。这种保护对于发射荧光是必需 的。
3，与其他报告基因不同的性质 ①从生化角度来讲, 所有已知的荧光素 酶都是氧化酶, 它利用分子氧来氧化底 物, 使产物分子处于一种激发态而发光。 这种酶/底物的相互作用是生物发光的普 遍模式。
微镜、荧光计、荧光激活细胞分选仪等 就可实现
4，GFP目前存在的不足 ( 1) 检测灵敏度还有待提高, 而且其 荧光信号强度方面的非线性性质使得 定量非常困难。
( 2) 新生GFP 折叠和加工成为具有荧 光活性形式的过程十分缓慢, 使得某 些快速过程如转录的激活过程还难以 用该方法进行研究。
( 3) 紫外激发对某些GFP 有光漂白和 光破坏作用, 导致荧光信号快速丧失。 ( 4) 多数生物具有微弱的自发荧光现 象, 并有着类似的激发和发射波长, 这 些荧光背景会影响某些GFP 的检测。
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2,GPAC 构成： 这是一个融合蛋白，它融合了红色荧光蛋白（RFP）单体Cherry和GFP的光激 活变异体。这种融合蛋白能够在表达标志物的细胞中持续发出红色荧光，而绿 色荧光只有在405-nm光激发下才会发出。 特点： ①表达GPAC的细胞在光激活前后都表现出强的红色信号，而绿色荧光只持续 数小时。 ②将某一特定蛋白放置在GPAC的N端或C端，均不影响其活性，也不会显著 影响胞内蛋白的定位或功能。即便融合伴侣需要大量的翻译后加工和修饰， GPAC仍可容忍。 不足：荧光标签相对较大，超过了50 kDa，这样，与GPAC融合的蛋白在用于 功能研究前就必须进行仔细的验证 其杰出性体现在：在时空动力学监测中突出了光转换的部分。
光发射波长改变。 与第一代荧光蛋白相比，它们的优势在于能脉冲标记细胞或分子亚群，从而实现复
杂的动力学时空分析
②典例：PAGFP，mRFP1，KFP1，Dronpa等 ③缺点：其中一些蛋白光转换效率不高，亮度较低，会迅速淬灭，或者需要多聚化。
此外，光转换通常伴随着第一种颜色的丧失，这样不得不借助计算机方法来查 看整个群体。
例如，要研究细胞内某蛋白质的 游走状态，则用荧光蛋白标记后， 其所处位置清晰可见。
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技术变革
①最早为水母体中提取的GFP
②在适当刺激下会改变结构从而发出或改变荧光
的第二类荧光蛋白FHP及其典例GPAC
③最新的PRIME技术
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而GFP 是第一个例外, 它的27kDa 的单 体由238 个氨基酸构成, 本身就是一个
生物发光系统。其荧光机制是自身含有 的, 绿色荧光的发射仅需分子氧的存在, 而无需其他外源辅因子
②GFP 的表达无种属特异性。不管细胞 的种类和位置如何, 都能够自主表达; ③GFP 还能克服穿透、毒素、光漂白等 不利因素[1]。GFP 的荧光可以耐受福尔 马林的固定, 因而可以制成长期保存的 标本; ④对细胞内GFP 的检测非常简单, 用显
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2，GFP发光原理 GFP控制光的部位是其自身的一部分， 仅由氨基酸构建而成，该部位含有一 段三个氨基酸组成的特殊序列：丝氨 酸－酪氨酸－甘氨酸（有时丝氨酸会 被相似的苏氨酸取代）。当蛋白质链 折叠时，这段短片段就被深埋在蛋白 质内部，然后，发生一系列化学反应： 甘氨酸与丝氨酸之间形成化学键，生 成一个新的闭合环，随后这个环会自 动脱水。最终，经过大约一个小时的 反应，周围环境中的的氧气攻击酪氨 酸的一个化学键，形成一个新的双键 并合成荧光发色团。
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荧光标记蛋白的发展
华中农业大学 工商管理0901 李佳佳
荧光标记蛋白技术实际上是也是一种标记技术。就如同最早用P标记脱氧核糖核 酸用S标记蛋白质是一样。
左图所示为验证 DNA和蛋白质谁 是遗传物质的实 验
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可荧 作光 为标 报记 告蛋 基白 因在 ，生 提物 供研 细究 胞反 内面 物的 质作 的用 跟： 踪荧 定光 位标
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PRIME技术
开发此技术的原因：无论是GPAC 还是GFP，他们都有一个缺点，蛋 白过大。一旦荧光探针过大，它们 就有可能干扰蛋白的正常功能，或 妨碍它们到达目的地。 如：238个氨基酸的GFP干扰了一 些蛋白的功能，比如肌动蛋白actin。 此蛋白参与了细胞分裂、运动及通 讯。然而研究人员发现，与GFP的 融合对肌动蛋白的功能和运输有着 不利影响。
随后，目的蛋白质与 荧光基团蛋白质同时 产生
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当7-香豆素这 种蓝色荧光探 针进入细胞后， 连接酶将它与 目的蛋白上的 短标签相连。 这便使融合荧 光蛋白发出可 见荧光
优点： ①使用这种方法后，标有荧光探针的肌动 蛋白能在细胞中自由游走，并穿过细胞核。 ②此方法能应用于细胞内特定区域的蛋白， 比如细胞核、细胞膜或细胞溶质。在连接 酶上加入一段信号肽，指导它到达特定区 域。之后，酶将荧光探针与此区域的蛋白 相连。
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FHP（fluorescent highlighter proteins光激活蛋白即第二类荧光蛋白）
GPAC 及

（Green ＿photoactivatable ＿ Cherry光激活绿樱桃）
1，第二类荧光蛋白，FHP ①特点 这些荧光蛋白在适当的刺激下会经历结构的改变，从而打开荧光这个开关，或者荧
记 蛋 白 的 基 因
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如图所示为肽链的形成过程
肽链经过 弯曲、折 叠、多条 肽链的重 叠等形成 蛋白质。
所以，如若 一开始便把 荧光标记蛋 白的基因插 入到某一特 定基因内， 则新的基因 会合成荧光 融合蛋白
如左图所示，当体内物质融合了荧光蛋 白后会发出荧光，用显微镜、荧光计、 荧光激活细胞分选仪等就可以看见，若 在靠近体表处且光源强烈则肉眼可视。
概述：PRIME技术使用一种比GFP小 得多的蓝色荧光探针。与GFP不同的是， 新探针一开始并不与目的蛋白相连。它 是在后来通过一种全新的酶而附在蛋白 上。这种全新的酶被称为荧光基团连接 酶。
Monday, May 13, 2019
原 理 ：
原理：在导入目的 基因的同时也将编 码这种酶的基因导 入细胞。还在目的 基因上加上了一个 短的标签（13个 氨基酸），此标签 让连接酶识别蛋白