实验四 碱性磷酸酶的动力学分析
酶促反应动力学：研究酶促反应速度及
其影响因素，并加以定量的阐述。
影响因素：酶浓度、底物浓度、pH、
温度、抑制剂、激活剂等。
在研究某种因素对酶促反应速度的影响时，
其余各因素均需保持恒定。
一、实验目的
1.掌握ALP活性测定的原理与方法 2.观察温度、pH、底物浓度、抑制剂对酶促反 应速度的影响。 3.掌握双倒数作图法测定km值的原理与方法。
以1/V对1/[S]作图， 得出一直线。
双倒数作图法
4.抑制剂对酶促反应速度的影响
酶的抑制剂：凡能使酶的催化活性下降而不引 起酶蛋白变性的物质。
竞争性抑制 可逆性 抑制作用种类
非竞争性抑制
反竞争性抑制
不可逆性
竞争性抑制曲线图
竞争性抑制剂与酶的底物结构相似,与底物竞争酶 的活性中心,从而阻碍酶与底物结合成中间产物。
特点： （1）V下降，发生抑制 （2）Vmax不变 （3）Km增大，亲和力下降
非竞争性抑制曲线图
抑制剂与酶活性中心以外的必需基团结合,不影响酶与底 物的结合,底物与抑制剂之间没有竞争关系。但酶-底物-抑制 剂复合物不能进一步释放出产物。 特点： （1）V下降，发生抑制 （2）Vmax减小 （3）Km不变
六、结果绘图
1、绘出pH对反应速度的影响，标出最适pH。 2、绘出温度（T）对反应速度的影响，标出最 适温度。 3、绘出1/[S]对1/[V]的直线图，求出Km和 Vmax。 4、绘出有抑制剂Na2HPO4时1/[S]对1/[V]的直 线图，求出有竞争性抑制剂存在时Km和Vmax 的变化。
[作图]
磷酸苯二钠法测定ALP的活性
本次实验以磷酸苯二钠为底物，碱性磷酸酶
(ALP)为催化剂，磷酸氢二钠作为抑制剂，分 别观察观察温度、pH、底物浓度、抑制剂对 酶促反应速度的影响。
ONa O-P=O ONa 磷酸苯二钠 C6H5 N
ONa
+
H2O
ALP
OH
+
HO-P=O ONa
酚
磷酸氢二钠 C6H5

底物浓度对酶促反应速度的影响
[S]与V的关系：米-曼氏方程
Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[S]为底物浓度
当[S]Km时，
，反应速率与底物浓
度成正比
当[S]Km时，VVmax，反应达到最大速率
Km与Vmax的意义
1. Km值

定义：Km等于酶促反应速度为最大速度一半时的底 物浓度，单位是mol/L。
根据图求 得Km和Vmax, 求出有竞争性 抑制剂存在时 Km和Vmax的变 化。 1/Vmax 1/V
-1/Km
1/[S]
七、注意事项
1.试剂较多，看清楚名称和浓度，认真实验， 取样要准确，加样顺序要一致，不能出错。 2.温度实验要保证温度。 3.作图时,实验点不在同一条直线上时,尽量使 各点平均分布在直线的两侧,两图画在同一坐 标纸上,便于判断。 4.每组做2个实验，数据交换使用。
三、试剂和仪器
pH8.0、9.0、10、11.5甘氨酸缓冲液、 0.04mol/L底物 10mmol/L底物 4-氨基安替比林 0.5%铁氰化钾 酶液 0.5mol/LNaOH pH8.8Tris缓冲液、 0.1mol/LpH10碳酸缓冲液 磷酸氢二钠 蒸馏水
二、实验原理
1.温度对酶促反应速度的影响 2.pH对酶促反应速度的影响 3.底物浓度对酶促反应速度的影响 4.抑制剂对酶促反应速度的影响 5.酶活性的测定
1.温度对酶促反应速度的影响
温度对酶促反应速率
具有双重影响 酶的最适温度 酶的最适温度不是酶 的特征性常数，它与 反应所需时间有关
反竞争性抑制曲线图
抑制剂与酶和底物形成的中间产物结合，使中间产物的量 下降。既减少从中间产物转化为产物的量，也同时减少从中间 产物解离出游离酶和底物的量。
特点: (1) V下降，发生抑制 (2) Vmax减小 (3) Km减小
竞争性抑制作用
竞争性抑制剂与酶的底物结构相似，与底物 竞争酶的活性中心，阻碍酶与底物形成中间 产物，从而抑制酶的活性。
H3C-N
Hห้องสมุดไป่ตู้C-C
C=O C-NH2
+
OH
K3Fe(CN)6
OH-
N
H3C-N
H3C-C
C=O C-N=
O
4-氨基安替比林
醌衍生物
醌衍生物为红色,根据红色深浅测出光密度值,计算不同 底物浓度时酶的反应速度（以产物的生成量表示）。
Lambert-Beer定律：
Ａ =ＫＣＬ
100mL酶液在37℃下保温15min产生1mg酚 为一个酶活性单位 。 从标准曲线查出释放出的酚量（µg）则 可计算出酶活性
竞争性抑制作用
米氏方程
V max[S] v Km(1 [I] / Ki) [S]
[E][I] Ki [EI]
双倒数方程
1 Km [I] 1 1 (1 ) v V max Ki [S] V max
竞争性抑制作用特点：
抑制剂与底物结构相似
两者都与酶的活性中心结合 抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及
抑制剂与底物浓度的相对比例，增加底物浓 度可减低或解除抑制作用 动力学变化：Vmax不变、Km值变大
5.酶活性的测定
酶活性：是指酶催化化学反应的能力，衡 量标准是酶促反应速度的大小。 酶促反应的速度（V）：通常用单位时间， 底物的消耗量或产物的生成量来表示，而一 般测定时都是以产物的生成量为准。

四、操作步骤
1.温度对酶促反应速度的影响 2.pH对酶促反应速度的影响 3.底物浓度对酶促反应速度的影响 4.抑制剂对酶促反应速度的影响
五、结果与计算
酶活性的计算：在37℃下保温15min产生1mg 酚为一个酶活性单位，从标准曲线查出释放 出的酚量（µg）则可计算出酶活性。
100ml酶活性 = 释放出的酚量（µg）× 1/0.1 × 100 × 1/1000 = 释放出的酚量（mg）
温度对淀粉酶活性的影响
2.pH对酶促反应速度的影响
酶促反应的最适pH pH通过改变酶与底
pH 对某些酶活性的影响
物分子解离状态影 响反应速率 最适pH不是酶的特 征性常数，它受底 物浓度、缓冲液种 类与浓度、及酶纯 度等因素的影响。
3.底物浓度对酶促反应速度的影响
当底物浓度较低 时,V随[S]的增大而 急剧上升,两者成正 比关系。 随着底物浓度继续 增加,反应速度增加, 而幅度不断下降。 若继续加大[S]，反 应速度就不再增加, 达到一个极限值 Vmax。

意义：a)Km可表示酶与底物的亲和力
b)同一种酶对于不同底物有不同的Km值 c)Km是酶的特征性常数，只与酶的结构、底物和反 应环境（温度、pH、离子强度）有关，与酶浓度无关
2.Vmax值：是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶 浓度成正比。
Km和Vmax值的测定
双倒数作图法：将米氏方程式两侧取双倒数，得