抗D-二聚体单克隆抗体的制备和鉴定1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 动物和细胞6周龄BALB/c雌鼠，体重18～22g，购于武汉大学实验动物中心；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞。

1.1.2 试剂小牛血清（NCS）——56℃灭活30分钟过滤除菌、HT及HAT选择培养液（筛选杂交瘤细胞，Sigma 公司）、8-氮杂鸟嘌呤（8-azaguanine）、RPMI 1640、Hank's液、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG （HRP-GAM-IgG）及鼠源McAb亚类检测试剂盒（Sigma公司/ Roche公司）、Western blot 试剂盒（Roche 公司）、96孔和24孔细胞培养板、5%脱脂奶粉、ELISA板、FPLC（快速蛋白液相层析）、弗氏完全和不完全佐剂（Sigma公司）、D-二聚体标准品、台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒（Sigma公司）、二甲基亚砜（DMSO，分析纯）、75%酒精。

1.1.3 主要仪器设备CO2培养箱、液氮、细胞计数板、酒精灯、玻璃平皿、平底烧瓶、200目不锈钢网筛、细胞培养板、培养瓶、解剖器械（剪刀和镊子）、加样枪及枪头（黄，蓝，白）、一次性无菌塑料离心管（15ml）、滤菌器、PH试纸、酶标仪、蛋白检测仪、蛋白纯化系统、高速冷冻离心机、低速大容量多管离心机、层析柱、倒置显微镜、电热干燥箱。

1.2 方法1.2.1 动物免疫首次免疫以100ug D-二聚体+完全佐剂按1：1乳化，于小鼠颈背部皮下多点注射；第二次和第三次改为不完全佐剂，其他免疫指标不变，于小鼠颈背部皮下多点注射。

注射量均为0.3ml/只。

1.2.2 ELISA法测定小鼠血清效价小鼠血清抗体效价应>1:10 000，融合前3天加强免疫一次。

1.2.3细胞融合前的准备1.2.3.1 骨髓瘤（浆细胞瘤）细胞的选择和培养：骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。

常用骨髓瘤细胞系有：SP2／0、NS1、P3/X63-Ag8.653等。

骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。

小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞浓度以104～105/ml为宜，最大密度不得超106／ml，一般扩大培养以1：3～1∶10稀释传代，传代培养要保持细胞的对数生长期（约105细胞/毫升，细胞形态规则要一致，圆而亮，有一定的立体感，机能要活跃，活细胞数在90—95%以上。

要得到这种细胞，其培养技巧在于，在融合前24小时，将生长良好的细胞全部自瓶壁冲下来，并除去1/2或更多的细胞，加入新鲜培养液令细胞重新贴壁分裂增繁），每3～5天传代一次，细胞的倍增时间为16～20小时，一般可间隔3天更换一次培养液（一般一传三或把一瓶细胞弃去一半后再一传二，这样24小时后又全部长满。

）。

细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮杂鸟嘌呤进行处理（15～20ug／ml），HGPRT阳性细胞利用8-AG后，合成毒性核苷酸而死亡，只有HGPRT阴性细胞能持续生长，从而避免细胞的返祖现象，使生存的细胞对HA T呈均一的敏感性。

上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁（半贴壁）生长，无须用姨蛋白酶消化，直接用吸管轻轻吹打即可使细胞分散。

骨髓瘤细胞的最高生长浓度为9X105／ml，倍增时间通常为10～15h。

一般在准备融合前两周就应开始复苏骨髓瘤细胞（融合前经8-氮杂鸟嘌呤筛选2周）。

用于融合试验前必须做对HAT选择培养基敏感性试验。

由于HGPRT酶缺损，DNA合成障碍细胞应发生死亡，否则有变异，不能用于试验。

为阻止出现返祖现象，确保该细胞对HAT的敏感性，在筛选建株时应在含8-氮杂鸟嘌呤致死剂的培养液中（20～30mg/L）培养一代后（条件摸索：两代），换成常规培养基培养。

融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95％），在细胞融合前1天用新鲜培养基调细胞浓度为2×105／ml，一般次日即为对数生长期细胞。

每3～6月应用8-AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。

复苏的主要步骤及注意事项见《医用细胞工程》第111页。

1.2.3.2 免疫脾细胞的制备：免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞一般取最后一次加强免疫3天以后（第4天，融合当天）的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

脾细胞悬液的制备：a 摘除小鼠眼球放血，留作阳性对照。

b 拉颈处死小鼠，用75%的酒精浸泡消毒小鼠皮毛3～5分钟。

c 无菌条件下打开腹腔取出脾脏，去除脂肪和结缔组织，用无血清的培养液（1640）或Hank's液洗去红细胞。

d 置不锈钢筛网上用注射器内芯研磨成细胞悬液后吸入小试管中，直立小试管3 min使大块的结缔组织下沉，把脾细胞悬液吸入离心管中（不锈钢筛网置于玻璃平皿中，加入洗液，用注射器内芯研磨好后，再用适量洗液将不锈钢筛网上的脾细胞冲入平皿）。

e 用洗液洗2次，再用无血清1640洗一次。

洗液充满离心管，经1000 r / min离心5 min（与此同时开始制备骨骼瘤细胞）。

f 弃上清加入完全培养基（10%FCS的RPMI 1640），用吸管吹打分散，收集上层悬液，除去沉下的大块。

g 用计数板进行细胞计数（第125页），细胞计数，并用培养基调整适当的细胞浓度（1～２×10８/L左右）置室温待融合用；以台盼兰染色用显微镜检查，活细胞数应高于80%为合格。

一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为1～２.5×10８/L左右。

1.2.3.3 饲养细胞的制备：为防止细胞融合时因损伤而难以生长、促进杂交瘤细胞生长、增加克隆数，常需制备饲养层细胞。

可用肉汤刺激小鼠腹腔并收获腹腔中的巨噬细胞，该细胞有助于清洁培养表面和吞噬死亡细胞。

小鼠腹腔巨噬细胞的制备：小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄↓拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟↓用无菌剪刀剪开腹部一小口，剥开皮肤，露出腹腔↓用无菌注射器注入5ml培养液↓反复冲洗，吸出液体/ 右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹1min，抽回腹腔内液体↓放入10ml离心管，1000转／分离心10min洗一次↓用10％小牛血清（NCS）选择培养液（HAT）混悬10～15ml；台盼兰染色计数活细胞，并调整细胞数至1～2×10５／ml。

（如果融合后发现培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再入一些。

）↓加入96孔？板包板培养，100μl／孔↓放入37℃CO2孵箱培养一般在融合前一天制备饲养细胞，一只小鼠可获得3～5×106个腹腔巨噬细胞，可供一次融合用，亦可取两只小鼠腹腔巨噬细胞混合使用。

此外，同系小鼠胸腺细胞和脾细胞等亦可作为饲养细胞。

若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞（3T3）1×105／ml，均为100μl／孔。

在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。

1.2.4细胞电融合用电融合仪进行细胞融合，骨髓瘤细胞与脾细胞的比值1：1（也可进行条件摸索，1：2、1：3等）。

融合后沉淀细胞悬浮于24 ml （不够可以少加一些）HA T培养基中，将细胞分种于含饲养细胞的24孔板中，0.5 ml /孔，置37℃、5%CO2培养箱中培养，每3～5天半量换HAT培养（吸出1/2旧液），15天后改用HT培养基，3周后改用普通完全培养液（完全RPMI 1640培养基）。

1.2.5HAT选择杂交瘤细胞及Ab检测筛选阳性细胞克隆融合后，大多数实验室在融合当天就加入HAT培养液，也可次日加入。

一般在融合后7～14天内使用HA T培养液，然后改用HT培养液（15天后）。

3～5天后未融合及自身融合的细胞逐渐死亡，1周左右可出现克隆，并不断增殖，一般在杂交瘤细胞布满孔底1/3～1/2面积时（约培养8～12天），即可取培养上清液进行特异性抗体检测，筛选出所需要的杂交瘤细胞系，同时补加新鲜培养液。

一旦检测到分泌预定抗体的克隆，应及时将阳性克隆转入培养瓶扩大培养，冻存部分克隆细胞，并尽快进行克隆化培养。

可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。

在一次较好的融合试验中，约70～80％孔有克隆生长。

所有生长克隆的孔都需要取培养上清液进行抗体活性检测。

检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

本试验选用ELISA法，可用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。

1.2.6杂交瘤阳性克隆化并扩大培养和细胞冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。

经过HA T筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。

在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。

要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。

克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。

即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。

1.2.6.1 有限稀释法的程序①阳性克隆化前一天制备饲养细胞悬液（同融合前准备）。

②取对数生长期的阳性孔细胞制成悬液，经台盼蓝染色计数，测定活细胞数及浓度（细胞存活率及单个细胞百分率应高于90%以上），用培养基在试管中稀释调整细胞数至1～5×10３／ml。

③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液（HT-1640，10%NCS），即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排（96孔板，每排12孔）为每孔2个细胞。

余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。

余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。

④次日在倒置显微镜下观察培养板各孔中的细胞数，挑选只含一个细胞的孔，做好标记并补加100ul 培养液继续培养。

⑤培养期间，视PH值的变化决定是否换液或补加培养液，1周左右，孔中有明显克隆出现（肉眼可见细胞克隆），及时进行抗体检测，扩大培养（待长至孔底面的1/3～1/2时，可将96孔中的单一克隆的细胞分别移至24孔板中进行扩大培养）并冻存细胞。