973课题结题报告课题名称：大豆重要新基因的发掘与有效利用研究课题编号：TG1998010206负责人：喻德跃承担单位：南京农业大学、中国农科院品资所、吉林省农科院协作单位：中国科学院遗传发育所2003年10月15日一、计划任务完成情况（一）计划任务本课题的任务：发掘大豆抗花叶病毒、抗食叶性害虫、产量有关性状、育性恢复系等新基因，明确遗传规律，并进行标记和定位。
具体指标如下：１、抗大豆花叶病（ＳＭＶ）基因方面：（1）标记到2－3个抗性基因, 纳入遗传图谱;（2）育成抗性品系１－２个,作为育种新种质。
２、抗食叶性害虫基因方面：（1）标记到１－２个抗性主基因,纳入遗传图谱;（2）育成抗性品系１－２个,作为育种新种质。
3、产量有关性状基因方面：（1）标记到3－4个产量有关性状的基因位点,纳入遗传图谱;（2）育成具2-4种特异性状的优良共同遗传背景家系(类似近等基因系),用于聚合重组。
4、质核互作雄性不育恢复基因方面筛选与恢复基因紧密连锁的分子标记〈10cM，对恢复基因进行定位。
5、发表SCI引用论文五篇以上。
（二）完成情况本课题鉴定出一批新的基因资源，包括：抗SMV（133份）、感SMV（122份）、抗食叶性害虫（9份）、感食叶性抗虫（10份）、产量性状（8份）、恢复系（10份），建立了重组近交家系群体（RIL）8个。
定位了9个新基因，获得分子标记10个，培育一批有育种价值的中间材料。
共计发表论文25篇，其中SCI收录6篇，国际特邀报告5篇,专著1部,培养研究生11人。
总体上超额完成了任务目标。
（三）主要进展1、资源鉴定与群体培育（1）抗大豆花叶病毒（SMV）方面鉴于国内大豆SMV株系鉴别寄主体系的混乱，在已经使用过的25个鉴别寄主中选拔出8个代表性寄主组成一套新的鉴别体系。
在长江中下游地区广泛采集病样（近300个样），以寄主鉴定为主、结合SMV的组织印迹检测技术和RT-PCR 检测技术，发现自20世纪80年代至今，SMV群体已经产生根本改变，尚未发现原先鉴定过的株系。
根据新鉴别体系的鉴定结果，确定了10个新株系（SC-1至SC-10），其中SC-8为强毒性株系群。
发现：SMV株系群组成复杂，同一株系群在不同地区的流行存在差异，同时不同株系群在同一地区的分布也有所不同。
综合1998-2002年的分析结果，认为：在株系组成上，黄淮地区以SC-3和SC-7为主。
长江中下游地区以SC-9为主。
测定了106份大豆品种（品系）对SC-7 、SC-8、SC-9三个株系群的抗性反应，筛选出17份对三个株系均表现高抗的材料；18份能兼抗三个株系中的两个株系的材料。
构建了抗X感杂交组合衍生的RIL群体：科丰1号X南农1138-2，F7：12，206个家系（见表1）。
用东北3号株系（SMV3）对355份大豆种质资源进行了SMV抗性鉴定（包括“七五”初鉴抗SMV材料40份，“八五”初鉴抗SMV材料91份，各地推广品种100份，农科院品资所新育成的品系35份，美国引进材料42份，韩国引进材料36份，泰国2份，日本1份）。
共筛选出116份高抗资源，117份中抗材料，122份高感资源。
（2）抗食叶性害虫基因方面综合1993-2002年的田间鉴定结果，获得一批高抗食叶性害虫和高感食叶性害虫的大豆种质。
高抗（HR）的品种9份：黄皮小青豆、日本、Larmar、PI227687、矮杆黄、York、阜阳170、SP26、早16号，抗（R）的品种15份，表现中间（M）的品种17份，感（S）的品种7份，高感（HS）的品种10份：大浦大粒黄、中豆19、南农86-4、南农86-4、江宁中老鼠豆、监利牛毛黄、花柒黄毛豆、沔阳白毛豆、吴江青豆、PI229358。
合成重组近交家系群体2个，包括：先进2号（感）X赶泰-2-2（抗）已推进到F7：9世代，含162个家系；和皖82-178（感）X 通山薄皮黄豆甲（抗）也推进到F7：9代，含159个家系（见表1）。
（3）产量性状基因方面获得了与提高产量潜力有关的资源8份，包括百粒重高（>40ｇ）、主茎节数多（>30）、短叶柄(<10cM)、曲茎、顶生长花序等。
构建了RIL群体2个，包括：南农87-23 X NG94-156（F7：8，175个家系）；波高（963069）X NG94-156（F7：8，156个家系）。
（见表1）（4）恢复基因方面获得利于大豆杂种优势应用的恢复系：10个。
阐明了细胞质不育的遗传模式：以栽培大豆不育系YA、保持系YB和含有不育细胞质的原始母本167为基础材料，配制了二个单交组合，四个三交组合，根据后代的育性和分离比例判断遗传模式。
试验结果表明：S(Rfrf)基因型F1花粉为半不育，F2可育与半不育分离比例为1：1；母本为不育细胞质S时，携带rf的雌配子有生活力，能传给后代，而携带rf的雄配子无生活力，不能传给后代。
母本为正常可育细胞质N时，携带rf的雌、雄配子均有生活力，可传给后代。
分离比例是单基因遗传模式。
因此该不育系属“单基因配子体不育”，即不育性由不育细胞质基因S和一对隐性基因rfrf控制，一个显性基因Rf的存在即可恢复育性。
明确了育性的稳定性：利用人工气候箱，设不同温度和光照长度处理，研究野生型大豆细胞质雄性不育系OA和保持系OB的育性稳定性。
鉴于试材原产于高温短日照的夏大豆区，本试验以14小时光照和昼夜温度30℃/20℃为对照处理，在14小时不变光照条件下，温度处理为35℃/25℃，30℃/20℃，25℃/15℃；在昼夜温度固定为30℃/20℃条件下，光照处理为15.5小时，14小时，12.5小时。
在上述所有处理中，不育系OA花粉败育率均保持在99%以上。
只有保持系在15.5小时光照时，花粉败育率上升到14.3%，这一结果表明，不育系OA在温度与光照大幅度变化的情况下，不育性极为稳定。
从细胞学方面明确了不育发生的时期：细胞学观察发现该不育系小孢子减数分裂正常，绒毡层亦无明显异常，不育发生的时期是在单核期以后。
表1 本课题培育的RIL 群体2、新基因发掘与分子标记抗大豆花叶病毒（SMV ）基因方面通过对P 1（科丰1号）、P 2（南农1138-2）、F 1和F 7：11 184个家系的田间抗性鉴定和遗传分析，发现科丰1号对SMV 株系群SC-7、SC-8、SC-9的抗性分别由一对显性基因控制，并将Rsc-7、Rsc-8、Rsc-9基因定位于N8D1b+W 连锁群上，与已经定位的三个抗性基因（Rsa 、Rn1、Rn3）位于同一连锁群，成簇排列。
此外，筛选到与抗性基因连锁的SCAR 标记和RAPD 标记，距Rsa 和Rsc 的距离分别为16.1和9.7cM 。
由于SC-7、SC-8、SC-9是新鉴定的SMV 株系群，而鉴定的抗性基因位点与已经发现的SMV 抗性位点位置不同，因而初步认为：Rsc-7、Rsc-8、Rsc-9 是新的抗SMV 基因。
此外，选育出NJR25-8、NJR32-8、NJR-44-1等综合性状优良、抗性好的中间材料。
利用高抗SMV3号株系的大豆品系95-5383与感病品种（品系）HB1，铁丰21，Amsoy ，Williams ，和抗病品种PI486355配制杂交组合，对各组合的F 1、F 2代接种SMV3号株系进行抗性鉴定，结果表明，95-5383与各感病品种的杂交组合F 1代表现为感病，抗病为隐性，F 2群体分离比例为1R ：3（S+N ），表明95-5383对SMV3号株系的抗性是受一对隐性基因控制。
PI486355X95-5383的F 2代有感病植株分离，95-5383的抗病基因与PI486355不在同一位点。
利用BSA 法对95-5383⨯HB1的99株F 2个体进行鉴定，筛选出与SMV 抗病基因紧密连锁的共显性RAPD 标记OPN11980/1070。
RAPD 引物OPN11在95-5383和抗池扩增出OPN11980片段，在HB1和感池扩增出OPN111070片段，在F 1同时扩增出OPN11980 和OPN111070。
用该引物分析95-5383⨯HB1的F 2个体，共显性的RAPD 标记OPN11980/1070与抗病基因的遗传距离为2.1cM 。
从95-5383和HB1中分别回收OPN11980和OPN111070特异片段，序列分析结果表明OPN11980和OPN111070的实际长度分别为986bp 和1084bp ，同源性为93.4%，主要差别是在两个不同区段插入（缺失）54bp 和35bp 的碱基。
用克隆的RAPD 片段OPN11980作探针（SOPN11）对亲本基因组DNA 进行Southern 杂交，结果表明OPN11980和OPN111070在大豆基因组中是以低拷贝形式存在。
根据克隆片段OPN11980和OPN111070的序列设计合成了一对SCAR 引物SCN11，SCN11在95-5383、HB1和95-5383×HB1的F 2群体扩增结果与RAPD 引物OPN11完全吻合。
用RAPD 引物OPN11和RFLP 探针SOPN11分析科丰1⨯南农1138-2重组近交群体（南京农业大学/中国科学院遗传发育所联合构建），将OPN11和SOPN11定位于F 连锁群的抗病基因簇上。
由于95-5383⨯PI486355的F 2代接种后有感病植株分离且抗病基因位于F 连锁群上与Rsv1不等位，表明可能定位的是新的抗病基因。
此外，用OPN11分析了68份抗性资源，其中有25份扩增出OPN11980，表明这些品种可能携带与95-5383相同的抗性基因，而其它扩增出OPN11980/1070和OPN111070的抗性品种可能携带不同于95-5383的抗性基因。
（2）抗食叶性害虫基因方面阐明大豆对食叶性害虫的抗性属于两对主基因加多基因的遗传模型。
应用皖82-178 X通山薄皮黄豆甲衍生的RIL群体在田间对纵合虫种进行鉴定，发现大豆对食叶性害虫综合虫种的抗性由两对主基因加多基因控制。
两对中效应较大的一对加性效应为10.5-10.7 (叶面积损失率, %), 效应较小的一对加性效应为4.4-7.2 (叶面积损失率, %), 而且两对主基因的遗传率较高, 达81.1-94.1%,多基因的遗传率较低, 为0-12.2%。
同样，应用皖82-178 X通山薄皮黄豆甲衍生的RIL群体在室内对单一虫种斜纹夜蛾进行养虫试验，也发现大豆对该虫种的抗性由两对主基因加多基因控制，主基因的遗传率为51.4%。
抗虫基因（QTL）有关的分子标记及定位。
应用皖82-178（感）×通山薄皮黄豆甲（抗）衍生而成的重组自交系群体（140个家系）开展养虫试验，研究各家系对斜纹夜蛾发育的影响，发现各家系对斜纹夜蛾发育的影响差异很大。