小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
由于其来源充足，取材相对方便，易于体外扩增，以及免疫原性低等优势，已经在组织工程和移植领域得到了广泛的关注。
本实验旨在建立一种分离、培养、纯化及鉴定MSCs的方法，并对其生物学特性进行研究，为后续利用骨髓MSCs治疗肝脏疾病的研究提供稳定的干细胞模型。
1 材料与方法1.1 材料与试剂清洁级昆明小鼠，雌雄兼用，体重25±2g，购自吉林大学实验动物中心［合格证号：SCXK（吉）2003－0001］；DMEM 培养基（美国GibcoBRL公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；淋巴细胞分离液（上海恒信公司），0.25%胰蛋白酶（华美公司），兔抗鼠CD34、CD44荧光抗体（美国PHARMINGEN公司）。
1.2 方法1.2.1 骨髓MSCs的体外分离、培养及扩增断颈处死小鼠，超净台上取胫骨和股骨，切开两端松质骨，并在骨干中部剪断，无血清DMEM-LG培养基冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，经Percoll密度梯度离心法，分离和收集有核细胞，用含15%FBS的DMEM-LG培养基重悬离心管中的MSCs，镜下细胞计数，使细胞密度达到1×106个／ml，CO2培养箱培养，换液，将MSCs不断纯化。
当细胞生长融合达80%－90%时，用1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化分散细胞，在显微镜下控制消化时间，计数细胞，以1∶3密度扩增培养。
此时标记为P1代，以后每3－4d换液1次；当细胞生长融合达80%－90%时，继续以1∶3的密度传代扩增培养，传代培养并记为P2代，余类推。
倒置相差显微镜逐日观察细胞形态和生长情况。
1.2.2 骨髓MSCs生长曲线的绘制取对数生长期的P1、P2、P3代 MSCs以1.0×105／ml密度分别接种在96孔培养板中，每3孔为一组，每孔100μl。
分别在接种后的第1d、2d、3d、4d、5d、6d，以MTT法测细胞活力。
每孔加入MTT溶液（5g／l）10μl，混匀。
继续培养4h，终止培养，小心吸弃孔内上清液。
每孔加入100μl DMSO溶液，振荡，镜下观察结晶物充分溶解后，在酶联免疫检测仪上测定各孔在490nm波长处的光吸收值，每组取3孔测定值的平均值。
以天数为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。
1.2.3 骨髓MSCs的细胞周期分析取生长状态良好的P3代细胞，0.25%胰酶消化，制成单细胞悬液，采用流式细胞仪直接荧光法检测细胞周期。
其中激发光源为15mW氩离子激光，波长488nm。
FACS软件收集细胞，Lysis软件分析处理数据，记录阳性细胞百分率。
1.2.4 骨髓MSCs表面抗原检测取生长状态良好的 P3代小鼠骨髓 MSCs，用1：1的EDTA（0.02%）和胰蛋白酶（0.25%）混合液进行消化，离心后弃去培养基。
PBS洗涤后制成浓度为1×106／ml的单细胞悬液。
在3个管中各加100μl细胞悬液，并标记为1，2，3号。
在1、2号管中分别加入兔抗鼠 CD34-FITC 10μl，CD44-FITC 10μl，3管中加入抗人IG-FITC 10μl，3管为阴性对照。
室温孵育30min，流式细胞仪检测。
2 结果2.1 昆明小鼠骨髓MSCs的基本形态新分离的MSCs呈小圆形，形态规整。
MSCs传代培养的细胞大小均匀，形态较一致，多为梭形，此时细胞不再以成克隆的方式生长，而是散在分布生长。
MSCs 连续传3代，细胞形态无明显变化，无衰老征象，传代周期6－7d。
表明MSCs得到了进一步的纯化及扩增。
P3代后的MSCs能较好的用于后期实验。
2.2 骨髓MSCs生长曲线测定由MTT法测定小鼠P1、P2、P3代各个时间点骨髓MSCs活率，绘制的生长曲线呈S型（见图1），由图可见，MSCs在接种后第1－2d为潜伏期，随后便快速增殖，进入对数生长期，持续2－3d，此后细胞增长逐渐减缓，进入平台期。
P3代的MSCs能较好的用于后期实验。
2.3 骨髓MSCs细胞周期分析结果取生长良好的三代细胞，采用流式细胞仪直接荧光法，检测细胞周期，记录阳性细胞百分率，见图2。
由图可见，75.27%的细胞处于 G0－G1期，表明MSCs具有强大的分化增殖能力。
2.4 骨髓MSCs表面抗原的表达流式细胞仪检测显示P3代小鼠骨髓MSCs强表达CD44，表达率为88.71%，基本不表达造血细胞表面标志CD34。
（见图3）。
3 讨论骨髓MSCs是具有多向分化潜能和高度自我更新能力的组织干细胞。
研究证实骨髓MSCs不仅可以分化为与其组织来源一致的细胞，而且具有跨系或跨胚层分化为不同组织来源细胞的潜能。
但骨髓中 MSCs的数量极少，仅占0.001%－0.01%［1］，要利用MSCs就必须对其进行体外分离、扩增。
现体外分离得到均一的骨髓MSCs的方法逐渐成熟，而通过体外扩增获得足够数量的间充质干细胞己实现。
分离骨髓MSCs的方法主要有四种：贴壁筛选法［2］、密度梯度离心法［3］、免疫磁珠分离法［4］、流式分选法［5］等。
后两种方法是目前获得MSCs纯度最高的方法，然而该方法操作复杂、费用及设备要求较高。
在分离中对细胞活性有一定影响。
图1 MSCs生长曲线图2 MSCs细胞周期图3 MSCs表面抗原的表达 A：CD34，B：CD44我们使用密度梯度离心和贴壁筛选相结合，利用Percoll（1.073g／ml）分离液将大部分造血细胞与单个核细胞分离开来，并经过体外贴壁培养一段时间，通过换液去除悬浮生长的造血细胞，获得较理想的骨髓MSCs。
我们用生长曲线来描述骨髓MSCs的生长繁殖能力，骨髓MSCs生长曲线分潜伏适应期、对数生长期和平台期。
发现昆明小鼠P1、P2、P3代骨髓MSCs的生长曲线均呈S型。
骨髓MSCs的生长性状稳定，P1、P2、P3代细胞的形态、生长曲线无明显差别，潜伏适应期1－2d，对数生长期2－3d，传代周期约6－7d。
MSCs具有无限增殖的能力，但前提是必须具备MSCs体外生长的最佳环境。
目前公认MSCs的培养必须用FBS做支持［6］，合适的血清浓度对细胞的生长具有关键性的作用。
血清中含有多种营养成分，对细胞的生长起着重要作用，但培养基中血清的浓度并非越高越好。