部，土壤(类型和土层)、岩石、水、昆虫和发酵 食品等； • 4．罗列出所要考察和测量的环境参数，如pH、 盐分、水分、氧化还原电势及温度等；
5．列出生物系统中有用的自然底物，如森林土 壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶；
6．根据上述1-5项中所获得的数据，设计分离方 法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸 出汁和培养条件；
↓ 3～5株
↓ 单株纯种分离
↓ 生产性能试验 ↓→毒性试验 菌种鉴定
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。
• 一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细 菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土 壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一 些野果生长区和果园内。
• 采样的对象也可以是植物，腐败物品， 某些水域等。
从自然界筛选
• 样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样 采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋 和塑料瓶等。
采样的注意事项
1、采样时应尽可能保持相对无菌； 2、所采集的样本必须具有某种代表性； 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集
日期、地点以及采集地点的地理、生态参数 等； 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为 真正的原地菌群的出现可能是短暂的；
第二章 生产中常用菌种的分离、 选育和保藏
第一节 菌种的分离筛选 第二节 培养分离 第三节 工业微生物育种 第四节 菌种的保藏及活化
带图象分析系统的微生物菌种 显微观察装置
第一节 菌种的分离简介
一、菌种的来源
• 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂 或菌种保藏部门索取或购买；
• 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
二、分离思路
• 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照 生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。
• 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。
• 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。
三、新种分离与筛选的步骤
（三）培养分离
• 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微
生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进 一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种 分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
11.稀.稀释释平平皿皿分分离离法法
(1)稀 释 1ml
1ml 1ml 1ml 1ml
• 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应 贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因 为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离 了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生 变化，微生物群体之间就会出现消长
（二）增殖培养
• 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性 培养基，选择一定的培养条件来控制。
• 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那 么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长， 而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段 的纯种分离就会顺利得多。
• 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
• 3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去 表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的 牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时 间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样 中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步 分批寄回，以便及时分离。
菌种筛选主要步骤
• 调查研究及查阅充分的资料 ↓
设计实验方案 ↓确定采集样品的生态环境
采样 ↓确定特定的增殖条件
增殖培养 ↓确定特殊的选择培养基及可能的 ↓定性或半定量快速检出法
平板分离 ↓
• 原种斜面 ↓确定发酵培养基础条件 筛选
↓ 初筛（1株1瓶）
↓ 复筛（1株3～5瓶） ↓结合初步工艺条件摸索 再复筛（1株3～5瓶）
1g
100ml 1/100
9ml
9ml
9ml
1/1000 10-4 10-5
9ml
10-6
9ml
10-7
9ml
10-8
1.稀释平皿分离法
a.倾注平皿分离法
b.涂布平皿分离法
2.平皿划线分离法 a. 连续划线分离法 b. 分区划线分离法
（四）筛 选
• 这一步是采用与生 产相近的培养基和培 养条件，通过三角瓶 的容量进行小型发酵 试验，以求得适合于 工业生产用菌种。
• 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生 长培养特性。
• 采样：有针对性地采集样品。 • 增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所
需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 • 分离：利用分离技术得到纯种。 • 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性
包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特 性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温 度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工 艺等。
一、成功的分离培养方法
(1)认真考它所需产品的特征和生产过程； (2)制订初步的筛选标准； (3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。
三、将生态学方法用于培养分离 的一般思路要点
• 1．罗列出所要分离的微生物类群； • 2．根据所采集样本的各种生态参数，描述所要
分离的微生物之生态系统或栖息地： • 3．将若干样本分成若干类型，如植物和植物各
7．用标准方法作对照来评价生态学分离方法；
8．根据待检材料的生态参数需要，修改已知的 方法；
9．运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛 选意义的微生物类群。
四、自然界中细菌的态系统中分离出具有代表性的 细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域 中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。
（五）毒性试验
• 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的， 将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品 工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定， 微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米 曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外， 其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒 性试验。
第二节 培养分离
• 从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
• 到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
• 在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。
• 因此，建立一更为科学的和针对性不强的分离方 法是必要的。