色谱柱使用保养知识
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内容
色谱柱应用基础 HPLC色谱柱介绍
色谱柱使用保知识
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高效液相色谱柱简介
色谱柱是一根填满填料的管子
柱管的材料(塑料,玻璃,不锈钢…)和尺寸(内径,长短)不尽相同
Waters HPLC色谱柱
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Waters 色谱柱发展历史
ACQUITY UPLC® BEH Amide ACQUITY UPLC® BEH Glycan XBridge Amide XSelect HSS HPLC Columns ACQUITY UPLC® HSS Cyano & PFP columns XSelectTM HSS Cyano & PFP columns XP 2.5 µm Columns
管内的填料更是种类繁多,主要分为三大类 – 硅胶基质 – 聚合物基质 – 无机和有机硅胶杂化基质 色谱柱的性能主要取决于填料的性质和填充技术
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硅胶颗粒的形状
不规则形状 (Irregular)
– 大硅胶颗粒研磨，筛分
– 不粒尺寸和表面积限制
有机基质 (高聚物)
杂化颗粒技术(具硅-碳键机制)
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第一代杂化颗粒的合成过程
Waters 专利技术 荣获2000年全球 R&D 100 大奖
硅甲基嵌入型聚乙氧基 硅烷 (MPEOS)
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四乙氧基硅烷 (TEOS)
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硅胶表面键合相的水解（PH<2）
O Si O O
H3C Si Cl CH3
OH
C C
C C
C C
C CH3
+
H3C
C Si C CH3
C C
C C
C CH3
O Si O O
O
+ HCl
Low pH (hydrolysis of ligand)
H3C
LiChrosorb RP-18
Symmetry C8 Resolve C-18
15
12 12
10.3
12.5 12.4
Ultrasphere ODS
Partisil ODS-3 mBondpak C-18 Nova-Pak C-18
11
11 10 7
11.3
12.0 7.9 5.5
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130Å and 300Å 1.7 um BEH Particles （电镜照片）
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填料的合成 —2.键合配体（键合相）
填料的内孔表面 流动相
色谱填料是多孔颗粒（“海绵” ），99％发生色谱分离的表面 是在内孔表面
Analyte
必须允许流动相进入内孔以 保证待分析和分离的化合物 能够和色谱填料有保留
OH
O Si O O
C Si C CH3
C C
C C
C CH3
+
HO
Note: Sometimes called “Column Bleed”
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硅胶的溶解（PH>8）
Nucleophilic attack
• Complete dissolution of Silica • Catastrophic column failure • Short lifetimes
• 因嵌入硅甲基的阻挡, 颗粒表面溶解速 度明显减缓 • 柱寿命大大延长
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XBridge:第二代杂化填料的合成
美国专利号 6,686,035 B2
硅胶基体中 插入的桥式乙基
EtO
CH2 CH2 OEt O Si Si O Si
O
OEt Si O Et O
O Si OEt O
4
O Et
EtO
Si
Si OEt EtO EtO
µBondapak™
Styragel® Spherisorb® DeltaPak® PrepPak® 1958 1984 1964 1973 1976 1979 1986 Symmetry® 1992 1994 SymmetryShield®
ACQUITY UPLC® BEH SunFire™ Columns XTerra®
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对色谱柱填料的了解(一)
键合相化学 – 影响化合物的分离度：α – 不同键合相对不同种类的化合物分离不同 – 可能导致色谱的分离机理不同 – 如：C18、C8、CN
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键合相色谱柱
以硅胶为基质，通过化学键合方式把C18、C8、NH2等 基团联在基质上，作为固定相 优点∶ – 固定相稳定，不易流失 – 应用广泛，可使用多种溶剂 – 消除硅羟基的不良影响
+
EtO EtO Si EtO
OEt CH2 Si OEt CH2 OEt
EtO
OEt
n
聚乙氧基硅烷 (BPEOS)
Anal. Chem . 2003, 75, 6781-6788 ©2014 Waters Corporation
四甲基硅烷 (TEOS)
双(三乙氧基硅基)乙烷 (BTEE)
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将高pH 柱稳定性推向新极限
甲基三乙氧基硅烷 (MTEOS)
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为何杂化颗粒柱可增加 在高pH下的柱寿命？
Surface modified Silica Particles XTerra® Hybrid Particles
普通硅胶柱
基于杂化颗粒的Xterra 柱
• 硅胶快速溶解 • 严重的柱失效 • 柱寿命短暂
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缺点∶
– pH值不能小于2(键合相水解) – 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同
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不同色谱填料的选择性差异
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选择性差异来源
填料的品牌-不同硅胶颗粒基质
o
o
密度，表面积，孔径
纯度(残留硅羟基活性不同)
注意：孔径是分布值
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Si-OH = 硅羟基(Silanol)
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平均孔径/孔体积
孔径/孔体积分布
– 大的孔径可分析高分子量 的分子
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填料的孔（多孔式液相色谱颗粒）
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残基处理的效果
① 抗坏血酸 ② 烟酰胺 ③ 对氨基苯甲酸 ④ 哌咯西叮 ⑤ 核黄素
⑥ 苯酚
⑦ 盐酸硫胺
NovaPak C18
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未封口 C18
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对色谱柱填料的了解(三)
含碳量
o
含碳量越高，k'值越大（固定相传质效应增加）
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Waters专利的柱填料颗粒
优点
无机基质 (C18 –硅胶)
• 机械强度高 • 柱效高 • 保留稳定 • 很宽的pH应用范围 • 无离子型作用 • 化学稳定性好
缺点
• 有限的pH应用范围 • 对碱性分析物拖尾 • 化学不稳定性 • 机械强度不佳 • 柱效低 • 保留行为难以预测
球形（Spherical）
– 目前流行的分析填料 – 形更好的性能，重现性
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C18 填料的合成 —1.硅胶基质的合成（多孔）
硅胶颗粒基质
硅羟基
Polyethoxysilane (PEOS)
Tetraethoxysilane (TEOS)
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对色谱柱填料的了解(四)
平均颗粒度，颗粒度分布 – 颗粒度
o
颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小) 柱压越高(渗透性差) 颗粒分布越宽:柱效低(渗透性差) 球型:柱效高、重现性好、柱床结构均匀 无定型：柱床结构不均匀,流动相线性速度不均 匀谱带扩展
ACQUITY UPLC® BEH200 SEC XSelect CSH HPLC columns ACQUITY CSH Columns Viridis SFC Columns ProteinPak High Rs IEX
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内容
色谱柱应用基础 HPLC色谱柱介绍
高含碳量
o
o o
有利于不易保留的化合物的分离
水解稳定性好，重现性好 有利于极性化合物的拖尾改善 有利于分析中性及碱性化合物 降低溶剂损耗
低含碳量
o o
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不同色谱柱的含碳量
色谱柱
Symmetry C18 Zorbax ODS C% 19 17 k'苊 (50/50的乙腈/水) 17 15.7