1.菌悬液的制备
a.ATCC6633枯草芽孢杆菌
将二代保存的菌株接种于普通细菌培养基平板上，30℃培养一星期后形成芽孢。用灭菌生理盐水洗下平板上发育的菌苔，用65℃加热30分钟，再于3000rpm离心20分钟后取掉上清液。让沉淀物在悬浮在灭菌生理盐水中，这就是芽孢原液。
b.ATCC9341藤黄微球菌
1.样品制备：方法同三3。
2.提取缓冲液配制：同二3（2）。
3.检定用平板的制备
（1）检测用培养基准备：将3瓶检测用培养基分装3个三角烧瓶内，各加入100mL蒸馏水，作好标记，121℃，15分钟高压灭菌后冷却到50℃备用。
（2）平板制备：三种菌液（必须充分振荡至无细胞沉淀物）各取1mL，分别按下表所示加入各自对应的检测培养基内，充分混匀（约10秒）后倾倒平板，每块平板约8mL。
试剂盒内提供AM8培养基干粉1瓶、AM5培养基干粉2瓶，藤黄微球菌ATCC9341菌悬液1瓶、枯草芽胞杆菌ATCC6633芽胞悬液1瓶、蜡样芽胞杆
QS-F006
作业指导书
第3页共3页
文件编号：QC-WI017(1)文件名称：抗生素残留量检验检方法-微生物抑制法
拟制：
审核：
批准：
菌蕈状变种ATCC11778芽胞悬液1瓶，土霉素标准纸片、红霉素标准纸片、卡那霉素标准纸片。
注：芽孢要染色显微镜观察确定芽孢达到80％以上才可。如果芽孢形成率达不到要求再培养数日即可，但如果培养10天以上，芽孢形成率还达
不到的话，试验菌可能变异，该试验菌不可使用。菌悬液冷藏（0-4℃）保存。
2.检定平板的制备在测定前，需进行预测试，以求得菌悬液最佳使用量。ATCC6633枯草芽孢杆菌的检定用平板，加0.1 mg/L（ppm）的标准工作液后,用30℃培养18小时后产生的抑制圈清晰、完整直径为12±1mm的菌悬液量为最佳。ATCC11778蕈状芽孢杆菌的检定用平板，加0.1 mg/L（ppm）的标准工作液后,用30℃培养18小时后产生的抑制圈清晰、完整直径为12±1mm的菌悬液量为最佳。
样液、标准液及阴性对照液（提取液），每份样品做两个平板上的平行试验，冷藏放置30分钟后，置30±1℃培养18±1小时。
四、结果报告：抑菌圈直径在10mm以上者为阳性，同时确认抗生素标准对照的抑菌圈在12mm以上。抑菌圈小于10mm，大于8mm的视为可疑，必要时重新测试，或用其它方法进行确认。
五、试剂盒检验方法
2、菌种：
ATCC9341藤黄微球菌（检测青霉素、氨基糖苷类）
ATCC6633枯草芽孢杆菌（检测大环内酯类）
ATCC11778蕈状芽孢杆菌（检测四环素族类）。
3.试剂和材料
除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
（1）标准液：
a.土霉素(四环素类)：用0.1N盐酸溶解后加入适量的灭菌去离子水配制成100mg/L（ppm）母液,用PH4.5磷酸缓冲液稀释至0.1 mg/L（ppm）。
QS-F006
作业指导书
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文件编号：QC-WI017（1）文件名称：抗生素残留量检验检方法-微生物抑制法
拟制：
审核：
批准：
工具设备/检验器具：
均质机、离心机、平皿、克氏瓶、恒温培养箱、牛津杯、蒸汽杀菌锅、游标卡尺
一、抽样
抽样数量
批次原料鳗数量（Kg）抽样条数检体数
1——2000 3 1
2000——5000 6 2
c PH6.0磷酸缓冲液:
称取磷酸二氢钾8.0g及磷酸氢二钾2.0g用蒸馏水定容至1000ml。
d PH8.0磷酸缓冲液:
称取磷酸二氢钾0.523g及磷酸氢二钾16.73g用蒸馏水定容至1000ml。
安全预防措施：
环境控制要求：
参考标准/法规/验收准则：
日本畜水产食品中的残留抗生物质简易检查法
SN/T 1750-2006
固定，每块平板放置4-6片滤纸片，通常每份样品需做两个平板上的平行试验。每一批样品做1-2个抗生素标准对照，用灭菌镊子将对照用标准纸片放置在相对应的琼脂平板上（见下表），用加样器在每片对照标准纸片上滴加100μL灭菌蒸馏水，轻压使其固定。已加好样的平板4℃冷藏放置30分钟后，30℃培养18小时。
试验平板
ATCC6633平板
ATCC9341平板
ATCC11778平板
对应使用的对照标准抗生素纸片
卡那霉素标准纸片
红霉素标准纸片
土霉素标准纸片
5.检验结果的判定
抑菌圈直径在12mm以上者为阳性，同时确认抗生素标准对照的抑菌圈在14mm以上。抑菌圈小于12mm，大于10mm的视为可疑，必要时重新测试，或用其它方法进行确认。也可根据试验菌的第三性初步判定抗生素种类。
菌种
培养基
ATCC9341
AM5
ATCC6633
AM5
ATCC11778
AM8
注：尽可能在无菌环境中倾倒平板，打开盖放置于水平台面上冷却1-2分钟后再盖上以减少冷凝水。未用完的平板密封后置4-8℃，可保存2-3天。
4.样品检定
在制备好的检定用平板的底部作好标记，用灭菌镊子将检测用滤纸片浸入提取液，吸足提取液后，放置在制备好的琼脂平板上00μL提取液），用镊子轻压使其
审核：
批准：
PH4.5、6.0及8.0磷酸缓冲液要用时才配制，如要保存要在121℃高压杀菌15分钟后密封保存。但如有混浊或有沉淀物时不可使用。
4.试验菌的保存
用普通的细菌斜面培养基30℃培养18小时后确认试验菌在斜面全体上发育后密封冷藏（0-4℃）保存。下代移植每隔一个月至一个半月执行。
三、测定步骤
将二代保存的菌株接种于增殖用肉汤中，30℃培养18小时的培养液作为试验菌液。
c.ATCC11778蕈状芽孢杆菌
将二代保存的菌株接种于普通细菌培养基平板上，30℃培养一星期后形成芽孢。用灭菌生理盐水洗下平板上发育的菌苔，用65℃加热30分钟，再将它至于3000r/min离心20分钟后取掉上清液。让沉淀物在悬浮在灭菌生理盐水中，这就是芽孢原液。
b.卡那霉素(大环内酯类) :用灭菌去离子水配制成100 mg/L（ppm）母液，用PH8.0磷酸缓冲液稀释至0.1 mg/L（ppm）
c.氨苄西林（氨基糖苷类）：用灭菌去离子水配制成100 mg/L（ppm）母液，用PH8.0磷酸缓冲液稀释至0.1 mg/L（ppm）
（2）缓冲液：
a.柠檬酸、丙酮缓冲液
残留抗生物质为“阴性”
必要的记录：
预难检验记录表
原料检验记录表
成品检验记录表
人员配备：
1人
1
增加参考标准,修改必要的记录
2007.10.8
0
2003.11.13
修订次
修订内容
生效期
QS-F006
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文件编号：QC-WI017(1)文件名称：抗生素残留量检验检方法-微生物抑制法
拟制：
ATCC6633
ATCC9341
ATCC11778
可检出抗生素种类
＋
或－
＋＋
＋
-
-
大环内酯类
或β－内酰胺类
＋
或－
-
-
＋＋
＋
四环素类
＋＋
或＋
-
-
+
-
氨基糖类类
注：“＋”表示有抑菌圈，“－”无抑菌圈。除上表所列的情况外，如果一个试样同时在多个平板上呈阳性，则表示可能同时含有多种抗生素残留。
1/5M柠檬酸溶液和1/2M氢氧化钾溶液等量混合溶液：丙酮：蒸馏=35：35：30比例调制。
1/5M柠檬酸溶液：称取柠檬酸4.2g用蒸馏水定容至100ml。
1/2M氢氧化钾溶液：称取氢氧化钾2.8g用蒸馏水定容至100ml。
b PH4.5磷酸缓冲液:
称取磷酸二氢钾13.6g用蒸馏水定容至1000ml。
将检定用培养基冷却至50℃左右，加入最佳量的菌悬液，使其充分混合后，每个平板注入8ml作为检定用平板。所用平板需当天制备。
3.样液制备
称取10.0g肉、内脏，加入柠檬酸-丙酮缓冲液20mL均质振荡后，80℃水浴保温20分钟，3000rpm离心15分钟后取上清液作为测试用提取液。
4.样液的测定
四类抗生素（青霉素类、氨基糖苷类、四环素族类、大环内酯类）残留量的检测：在制备好的检定用平板的底部作好标记，上放牛津杯，分别滴加
5001——10000 9 3
10001——15000 12 4
15001——25000 15 5
25001——21 7
二、测定方法
1.检测原理：用含有敏感菌的琼脂作成平板，上放小管或滤纸片，在管中或纸片上滴加已知抗生素标准液和未知试样液，经培养后，抗生素标准液管或纸片周围琼脂不生长细菌，即为抑菌圈，如试管周围也出现抑菌圈表示含有抗生素。