FITC最便宜，适用于强表达抗原
• 间接标记 适用范围广, biotin-avidin不适合
弱抗原的检测
数据处理系统
流式细胞分析的信息
• • • • • • Forward scatter(FSC) Side scatter(SSC) FL1-FITC FL2-PE FL3-PerCP PL4-APC
• 细胞凋亡与坏死的区别 虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但 它们的过程与表现却有很大差别。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理 化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过 程。表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物 外溢，核变化较慢，DNA 降解不充分，引起 局部严重的炎症反应。 凋亡是细胞对环境的生理性、病理性刺激 信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应 答有序变化的死亡过程。其细胞及组织的变化 与坏死有明显的不同。
微小残留病变的检出（MRD）： MRD是白血病复发的主要根源， FCM的高特异性和敏感性可以在患 者缓解期检测是否有残留病变细胞， 早期探测MRD，以免复发。
流式细胞术与强直性脊柱炎
有证据表明外周血淋巴细胞HLAB27的表达及其表达程度与强直性脊髓炎 的发生有很大相关性，利用流式细胞术 进行HLA-B27检测，可同时排除交叉反 应，是目前检测HLA-B27的最好方法。
流式细胞术与PNH
利用流式细胞术检测阵发性睡眠性 血红蛋白尿（PNH），根据血细胞的细 胞膜所缺乏的糖化肌醇磷脂（GPI）所连 接的蛋白，如DAF（CD55）与MIRI （CD59），来确诊此病，比传统的血清 溶血试验具有更高的特异性与敏感性。
流式细胞术与血小板
血小板： 巨血小板 血小板无力症
外周血、骨髓、癌组织、癌旁组织、 石蜡切片、各种体液（尿、脑脊液、胸 腹水等）
单细胞生物、特殊处理的植物细胞、某些非 细胞粒子、可溶性分子
记的单抗染色 鞘液 经处理的细胞单个通过激光聚焦区 检测散射光、荧光
信号转化、放大
计算机数据处理 分选
SORTING（细胞分选）
FCM通过精确定量DNA含量，能对癌前病 变的性质和发展趋势作出判断，有助于癌前病 变的早期诊断。
DNA倍体分析有助于临界性肿瘤的 诊断，如卵巢交界性肿瘤，异倍体的出现 与病变的恶性发展有关。
DNA异倍体、高S期细胞比值和高增 殖细胞核抗原（PCNA）表达与细胞增殖 能力、恶性程度和不良预后呈正相关。
为治疗方案和药理学研究提供依据：不同 类型的肿瘤对化疗药物的敏感性不同。可利 用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特 异性药物或非周期特异性药物。 MDR是由多药耐药基因编码的P糖蛋白 （P-gp）亲脂化合物，包括多种抗癌药物和荧 光染料的跨膜性排出泵。从人淋巴细胞排除 荧光染料与细胞内P-gp的含量直接相关。当淋 巴细胞出现MDR阳性细胞时，患者对化疗药 物开始出现耐药性，需要考虑其他治疗方式。
流式细胞术与生殖医学
正常男性精液中均为单倍体细胞，而由于精子发 生障碍所致不育的男性精液中会出现大量2倍体和4倍 体细胞。
1、精子的有无 2、精子形成过程中那一步发生阻滞
（四）流式细胞术在植物研究领域的应用
流式细胞分析在人类基因组计划中发 挥了重要作用，流式细胞技术的应用也适 用于植物，目前这个技术应用范围包括流 式核机
光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合 用于临床
第二类－－大型机
科研型，分辨率高，可分选用于培养，可选配多种激光器，更灵活
第三类－－新型流式细胞仪
装配有2～4根激光管，同时检测15个参数，高速分选达50000个/s
流式细胞仪的主要组成部分：
亚二倍体峰（凋亡峰） --- PI staining 不能区分凋亡与死亡细胞
Annexin V Assay 建议用于悬浮细胞
Annexin V Assay 能够区分死亡与凋亡
细胞周期
M
G2
G1 S
G0
Quiescent cells
（二）定量流式细胞术 （quantitative flow cytomety) 通过检测标准微球的荧光强度获得 标准曲线，通过标准曲线求得待测细胞的 某种生物分子的精确数值，从而反映在某 种生理病理条件下出现的微细变化，对临 床疾病的研究、诊断及治疗等具有重要意 义。
荧光显微镜 人脑 紫外光 放于固定的标本 台上 低 几十个细胞/分
结果
功能
精确、客观
可同时测多个参 数、能进行分选
有主观因素
一般只测一个参 数、不能分选
鞘液系统
流动室
光路系统
检测区
光学原理
laser
抗体标记的方法
抗体的选择
• 首选直接标记抗体 • 荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原
流式细胞术的原理 及其应用
马洪星
FLOW CYTOMETRY 流式细胞术 FLOW CYTOMETOR 流式细胞仪
• Flow Cytometry
– Measuring properties of cells in flow
• Flow Sorting
– Sorting (separating) cells based on properties measured in flow – Also called Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
微球流式芯片技术 CBA(Cytometric Bead Array)
采用夹心法分 析策略,以微珠 来捕获可溶性 分子。
（三）流式细胞术的临床应用
• • • • • • • 白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞 PNH诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验
遗传 HEREDITAS(Beijing)27(3):461~465,2005 <流式细胞术分析和分拣植物染色体> 流式细胞术在富营养淡水湖泊微型浮游植物细胞中的应用 细胞生物学杂志 2004，4，26卷第2期
（五）流式细胞术在环保领域的应用
粉尘粒子
随着白细胞分化抗原意义的确 认以及单克隆抗体技术的发展， 随着人们创新意识的加强，结合 计算机技术和其他技术，流式细 胞仪的应用领域将不断开拓，成 为科研与临床不可或缺的重要工 具。
细胞凋亡的生物学意义
胚胎形成、肌体正常发育、衰老和 损伤细胞的清除以及肿瘤的发生、发展 和转归等都与细胞凋亡有关。
生物医学的研究热点
凋亡检测
每一步都有检测试剂盒
每一步都有检测试剂盒
流式细胞术检测细胞凋亡
1、半胱氨酸蛋白酶3检测法（早早期） 2、Annexin V-FITC/PI 法（早期） 3、Apo2.7检测法（早期） 4、TUNEL 法（晚期） 5、DNA含量分析法（晚晚期） 6、细胞凋亡相关基因的流式细胞术检测
流式细胞术与移植
利用流式细胞仪可对器官移植和骨髓移 植后的患者进行监控。当患者CD3+、CD25+持 续增加提示已开始发生排异，CD4+/CD8+ T持 续下降，表明有感染发生，当其比值小于0.2 时必需停用免疫抑制剂。
其它免疫性疾病分析
SLE患者的淋巴细胞变化可 以反应该病的活动情况和器官侵 犯程度，活动或非活动性伴有多 系统疾病，但无肾脏损害的患者 可出现CD4+ CD8+T比值升高， 伴 有严重肾脏损害的SLE患者可出 现低CD4+、高CD8+的现象。
流式细胞术是20世纪70年代发展起
来的一种技术，有人将流式细胞仪比 喻成高级的荧光显微镜。 目前，该技术以广泛用于生物及医 学基础研究与临床检测，在分子生物学、 免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领 域内发挥着重要作用。
流式细胞仪 控制 光源 标本 效率 电脑 激光 制备成的单细胞 （或颗粒）悬液 高 几百~几万个 细胞/秒
网织血小板
血栓性疾与血栓前状态： 由于活化血小板是血栓的 主要成分之一，也是引起血栓 形成的主要原因，所以血小板 活化程度的增高与疾病的发生 发展有关。
流式细胞术与网织红细胞
流式细胞术与肿瘤
DNA非整倍体的出现可能是恶变细 胞的重要标志， FCM在肿瘤学上的应用， 主要是利用DNA含量测定，进行癌前病 变及早期癌变的检出、化疗指导以及预 后评估等工作。 癌前病变的癌变率与病变的增生程 度一致，而增生程度与DNA含量的异常 改变又呈平行关系。
流式细胞术与造血干细胞移植
流式细胞术与白血病免疫分型
流式细胞的免疫分型：
• 是白血病分型的重要指标，而白血病分 类是选择化疗方案和判断预后的重要依 据。 FAB标准(MICM)，形态学、免疫表型 染色体、分子生物学结合, • 适合于白血病的分型诊断，但不适合用 于确诊是不是白血病。 • Minimal residual diseases (MRD)
散点图适用于：多参数分析
流式应用常见范围
• • • • • • • 细胞大小 细胞的颗粒度 细胞表面分子：CD 系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53 细胞功能检测：细胞周期、凋亡 其他（膜电位、钙离子浓度、核酸等）
实验对照的设计
• 空白对照：ALL • 阴性对照：常用同型抗体对照
淋巴细胞亚群分析 机体免疫状态是衡量机体是否罹患 疾病的重要指标，目前多采用流式细胞 术来检测机体的免疫状态，其中最重要 的指标是检测T,B,NK淋巴细胞的水平。
常用细胞表型及意义 （cluster of differentiation,CD)
CD3 总T细胞 CD4 T辅助/诱导细胞亚群 CD8 T抑制/细胞毒细胞亚群 CD19 B细胞抗原 CD16+56 NK细胞 CD33 髓细胞前体 CD34 多能干细胞
流式细胞的基本信息: “形态”
流式细胞的主要信息:Fluorescence
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