Ligand surface
• High density ligand weakened serum binding background
Binding level，regeneration
5. 解离慢的互作可以采用三倍稀释
6. Biacore 3000和T100数据的一致性
仪器 Biacore3000 BiacoreT100
0 2 4 6 ug/ml 8 10 12 14 16
200 0
测定小鼠血清中针对某种抗原的抗体浓度， 建立标准曲线时发现购买的样品有问题。

2. 寻找好的再生条件有利实验的重复性 和稳定性
Yang X, et al. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2014
Gong Y, et al. Nat Struct Mol Biol. 2011
6. 其它技术有一定局限性：亲和力太强， 超过了ITC测量的最佳范围
Ding J, et al. J Biol Chem. 2012
ITC测定的亲和力为1.6 nM，是ITC技术直接测定 亲和力的极限！
Biacore适合测定nM级亲和力，并得到动力 学数据，了解互作的动力学过程
KD = 4.83 Χ10-8 M
原因:逐项排除，最后发现是缓
冲体系的问题，pH出错。 重新制备缓冲液后验证。
100
200 Tim e
300
400
500 s
4. 浓度测定时可以不用对照通道
Gly-HCl
Negative serum
Gly-HCl
Negative serum
Blank surface
实验操作和样品准备是完全独立的，亲和力完全一致。
总结
Biacore技术：发现相互作用
确定相互作用 定量相互作用 浓度测定 准备工作非常重要：样品准备和文献调研 实验者最好全程参与Biacore实验
谢 谢！
ca p tu ring m ole c ule
Response
lig a n d
-100
0
100
200 Tim e
300
400
500 s
Streptavidin-biotin, PBST, 12.5-250 nM
RU
Anti-human IgG, HEPES
亲和力相差40倍！
Response
70 60 50 40 30 20 10 0 -10 -100 0
3. 实验样品和缓冲液的认真准备
采用两种捕获方式测定某一人源抗体与抗原的亲和力
RU 120
KD = 3.35×10-8 M
RU 180 130 80 30 -20
KD = 8.31×10-10 M
a na lyte
Response
100 80 60 40 20 0 -20 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Tim e s
SPR实验证明：
4. 获得复合物结构后，通过Biacore实验 找出作用面上的关键氨基酸残基
Zhang Z, et al. Mol Microbiol. 2010
5. 样品是混合物，测定某种生物分子的 活性浓度
标准曲线
检测细胞培养上清中抗体 的活性浓度
6. 其它技术有一定局限性：快结合快解离 EMSA技术很难测出来
ka (M-1s-1) 2.38×106 2.401×106
kd (s-1) 1.63×10-3 1.651×10-3
KD (M) 6.87×10-10 6.878×10-10
Rmax（RU） 33.4 16.54
Capture level: 152 RU for 3000 and 69.2 RU for T100. Regeneration: 15-s pulse of 20 mM HCl. Kinetic assay: concentrations: 0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 0, 5 nM. injection time: 90 s; dissociation time: 180 s; flow: 40 µ l/min.
Biacore应用交流
陈 媛 媛 中国科学院生物物理研究所 蛋白质科学研究平台 2015.4.16
主要内容
案例分享：Biacore技术提供了哪些重要信息。
实验体会：如何得到理想的Biacore数据。
使用的仪器
Biacore 3000 （2005年启用）
Biacore T100 （2010年启用）
ka
kd
表面等离子共振技术(SPR) 分子间互作的动力学分析 KD = kd/ka
案例分享
1. 通过Biacore技术确定新的调节细菌趋 化性的方式
Li R, et al. Mol Microbiol. 2010
2. 获得重要蛋白复合物结构，补充生化 实验
Gong Y, et al. Nature, 2008
Biacore实验体会
1. 样品的活性和均一性是最重要的！
RU 250 200 150
7.8-500ug/ml
100 80 60 40 20 0
25 75 125 Time 175 225 s
7.8-500ug/m l
Response
100 50 0 -50
RelResp
Bad ligand
0 100 200 Conc 300 400 500
3. 搭建结构到功能的桥梁
Li X, et al. J Biol Chem. 2006
蛋白的生理功能是通过相互作用实现的，得到单一蛋白结构后，通过Biacore实验， 分析互作机制，将结构和功能联系起来，扩展文章的深度。
3. 搭建结构到功能的桥梁
Wang D, et al. Nat Immunol, 2010
0.01-16ug/m l
RU 2000 1500 1000
0.01-16ug/m l
1800 1600 1400 1200
Response
RelResp
1000 800 600
500 0
400
-500 -1000 50 100 150 Time 200 250 300 350 s
Good ligand