蛋白质提取常用试剂及操作方法一、原料选择和前处理（一）原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。

但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。

原料的选择主要依据实验目的定。

从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。

尽量要新鲜原料。

但有时这几方面不同时具备。

含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。

一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。

要事前调查制备的难易情况。

若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。

如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。

但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。

研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。

可能时尽量用全年均可采到的原料。

对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。

（二）前处理1.细胞的破碎材料选定通常要进行处理。

要剔除结缔组织及脂肪组织。

如不能立即进行实验，则应冷冻保存。

除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。

不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。

如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。

⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。

常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。

小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。

但在磨细时局部往往生热导致变性或pH 显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。

磨细剂的吸附也可导致损失。

⑵物理方法主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。

Ⅰ.反复冻融法于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。

由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。

Ⅱ.冷热变替法将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。

Ⅲ.超声波法暴露于9～10 千周声波或10～500 千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便且效果也好，但一次处理量较小。

应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。

处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。

Ⅳ.加压破碎法加一定气压或水压也可使细胞破碎。

⑶化学及生物化学方法Ⅰ.有机溶媒法粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5～10 倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。

蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。

用少量乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。

Ⅱ.自溶法将待破碎的鲜材料在一定pH 和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。

比较稳定，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化。

利用该法可从胰脏制取羧肽酶。

自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。

应防止细菌污染。

于温室30℃左右较早溶化。

自体融解过程中PH 显著变化，随时要调节pH。

自溶温度选在0～4℃，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用。

Ⅲ.酶法与前述的自体融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去变性蛋白质。

但值得提出的是溶菌酶处理时，它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类。

能溶解菌的酶分布很广。

尤其卵白中含量高，而多易结晶化。

1g 菌体加1～10mg 溶菌酶，pH6.2～7.01h 内完全溶菌。

于生理食盐水或0.2mol 蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形质没有脱出。

除溶菌酶外，蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。

表面活性剂处理：较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡淀及去氧胆酸钠等。

此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破。

2.细胞器的分离制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离，对于制备一些难度较大需求纯度较高的生物大分子是有利的。

尤其近年来分子生物学、分子遗传学、遗传工程等学科和技术的发展，对分布在各种细胞器上的核酸和蛋白质的研究工作日益增多，分离各种细胞器上的各类核酸和特异性蛋白质已成为生物大分子制备工作重要内容之一。

各类生物大分子在细胞内的分布是不同的。

DNA 几乎全部集中在细胞核内。

RNA 则大部分分布于细胞质。

各种酶在细胞内分布也有一定位置。

因此制备细胞器上的生物大分子时，预先须对整个细胞结构和各类生物大分子在细胞内分布匹有所了解。

以肝细胞为例整理如表1。

表1 蛋白质、酶及核酸在肝细胞内分布情况细胞器名称主要蛋白质及酶类核酸类细胞核：精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系RNA占总量10%左右，DNA 几乎全部。

粒线体：电子传递、氯化磷酸化、三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸氧化、脲合成等酶系RNA 占总量5%左右，DNA 微量。

内质网（微粒体）：蛋白质合成酶系、羟化酶系RNA占总量50%左右。

溶酶体：水解酶系（包括核酸酶、磷酸脂酶、组织蛋白酶及糖苷及糖苷酶等）。

高尔基氏体：糖苷转移酶、粘多糖及类固醇合成酶系。

细胞膜：载体与受体蛋白、特异抗蛋、ATP 酶、环化腺苷酶、5’-核苷酸酶、琥珀酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸酶等。

细胞液：嘧啶和嘌呤代谢、氨基酸合成酶系、可溶性蛋白类RNA（主要为tRNA）占总量30%。

二、蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法1、蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。

盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。

由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。

一般温度低蛋白质溶介度降低。

但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。

（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。

（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。

因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。

蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。

其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。

硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。

蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。

此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。

2、等电点沉淀法蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。

3、低温有机溶剂沉淀法用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。

（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法1、透析与超滤透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。

超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。

2、凝胶过滤法也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。

柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。

（三）根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。

1、电泳法各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。

值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。

2、离子交换层析法离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。

（详见层析技术章）（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。

这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。

其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。