•显微镜下 获取茎尖
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•接种
•盖好瓶塞
组织培养第九章植物脱毒技术
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•脱毒马铃薯试管苗
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3．培养
25+2℃ ，1500-5000LX，10-16h 一般光照培养比暗培养效果好。其间应更换新 鲜培养基。提高培养基中BA的浓度可形成大量从 生芽。 4．生根诱导 诱导生根的方法是将2-3cm高的无根苗转入生 根培养基继续培养1-2个月可生根。
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四、分子生物学鉴定 1、双链RNA法
通过提取纯纯化待测植物RNA，并对其进行电 泳分析，可确定dsRNA存在，从而判断待检植物是 否带病毒。 2、互补DNA（c DNA）检测法
也叫DNA分子杂交法
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叶片上产生黄斑、沿叶脉条斑
叶和茎干锈斑、坏死斑 叶片出现褪绿斑点、线纹斑及环斑、 局部坏死、畸形；叶脉间出现星状 透明斑
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葡萄卷叶病毒 葡萄茎沟病毒 葡萄栓皮病毒 葡萄金黄病毒
欧亚种葡萄 Kober 5BB LN33 Baco 22A
葡萄脉坏死病 110R
葡萄脉斑驳病 河岸葡萄
苹果 柑橘 葡萄 草莓
桃 梨
感染病 毒种类
36 23 26 24 23 11
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• 所谓脱毒就是采用一定的方法除去植 物体内病毒的技术。 • 无病毒苗：指不含该种植物的主要危 害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的 存在表现阴性反应的苗木。
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• 危害一些植物的病毒数目
植物种 类
菊花 康乃馨
水仙 唐菖蒲 风信子
月季
感染病 毒种类
19 11 4 5 3 10
植物种 类
矮牵牛 百合
马铃薯 大蒜 豌豆 樱桃
感染病 毒种类
5 6 17 24 15 44
植物种 类
9组织培养第九章植物脱 毒技术
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2020/11/30
组织培养第九章植物脱毒技术
•目的与要求
• 了解脱毒意义，学习植物茎尖脱毒原理及 其操作程序，了解其他组织脱毒方法及应用， 掌握植物理化脱毒方法。学习植物脱毒苗的鉴 定方法，掌握各方法的鉴定原理，了解植物脱 毒苗的保存和繁殖方法。 • 具备植物茎尖脱毒技术基础，具有指示植物 鉴定脱毒苗的基本能力，有脱毒苗保存的认知。
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三、其他组织培养脱毒方法 （一）愈伤组织培养脱毒
将感染病毒的组织离体培养获得愈伤组织， 再诱导愈伤组织分化成苗，从而获得无病害毒植 株的方法，即愈伤组织培养脱毒法。
部分愈伤组织细胞不带病毒可能有以下两方 面的原因： 一是愈伤组织细胞分裂增殖速度快，而病毒复制 速度较慢，赶不上细胞的繁殖； 二是愈伤组织发生了抗病毒突变。
生组织不能合成自身需要的生长素，但下部叶原基 能提供，因而带叶原基的茎尖生长快，成苗率高。 但茎尖越大，脱毒效果差。
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（二）茎尖脱毒方法 1、取样与消毒
可直接选定的植株上取顶芽进行消毒接种。采 顶芽与侧芽消毒接种 。
马铃薯Y病 毒（PVY）
马铃薯卷 叶病毒 （PLRV）
指示植物
表现症状
千红日、曼陀罗、辣 椒、心叶烟
脉间花叶
苋色藜、千日红、曼 陀罗、昆诺阿藜
叶脉深陷，粗缩
野 曼生陀马罗铃薯、洋酸菜、随微品品花种种叶反而 或 应异 粗 为， 缩 坏有 ， 死些 敏轻 感
洋酸菜
叶尖呈浅黄色，有些 品种呈紫色或红色
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（二）珠心胚培养脱毒 柑橘类种子为多胚种子，除具有合子胚外还有珠
心胚，种子一般不带病毒，因此珠心胚植株不易带 病毒。 （三）微尖嫁接脱毒
指在人工培养基上培养实生砧木，嫁接无病毒茎 尖（0.14-1.0mm,带3-4个叶原基），以培养脱毒苗 的技术。 脱毒程序：无菌砧木培养——茎尖准备——嫁接— —嫁接苗培养——移植。
桃细菌性穿孔病
萎蔫
棉花枯萎病、茄科植 物青枯病
矮化
玉米矮化病、泡桐丛 枝病、小麦丛矮病
徒长 水稻恶苗病
疮痂
柑桔疮痂病、梨黑星病、马 铃薯疮痂病
卷叶 马铃薯卷叶病
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•指示植物法
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•几种马铃薯病毒的指示植物及表现症状
病毒种类 马铃薯X病 毒（PVX） 马铃薯S病 毒（PVS）
•酒精灯灼 烧
•酒精擦拭培养 皿 组织培养第九章植物脱毒技术
•2、茎尖剥离和接种
• 将已消毒的芽放在带滤纸的培养皿上—器械
固定—解剖镜下剥去幼叶—切下带1-2个叶原基的 生长点（0.3-0.5mm）—切下的茎尖转至培养基 上（顶部向上）。
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•酒精擦拭
•旋转灼烧
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定确系无特顶病毒者，既是无病毒原种。
• 无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有
可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到无病
毒苗，就应很好保存，这些原原种或原种材料保
管得好可以保存利用5～10年。
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组织培养第九章植离保存 • 通常无病毒苗应种植在隔虫网内，使用300 目，即网眼为0.4～0.5mm大小的网纱，也可用盆 栽钵。栽培用的土壤也应进行消毒，周围环境也 要整洁，并及时喷施农药防治虫害，以保证植物 材料在与病毒严密隔离的条件下栽培。 另一种更 便宜的方法，是把由茎尖得到的并已经过脱毒检 验的植物通过离体培养进行繁殖和保存。
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•五、电镜检测法 运用电子显微镜可直接检测待检植物体内有无
病毒粒体存在，并根据所观察病毒的形态等对病毒 种类进行鉴定。是较为先进的方法，但需一定的设 备和技术。
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•
第三节 无病毒苗的保存和繁殖
• 通过不同脱毒方法所获得的脱毒植株，经鉴
三、抗血清鉴定法 特异性高，测定速度快，几小时甚至几分钟就可 以完成。植物病毒鉴定中最有用方法之一。 （一）原理
刺激抗体产生蛋白质抗原。抗原与抗体间能 发生高度专一性的血清学反应（免疫反应） （二）方法 1、叶绿体凝集法 2、块茎沉淀法 3、环形接口法 4、酶联免疫法：用梅标记抗原或抗体的微量测 定法。现在灵敏度较高和常使用的方法。
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（三）培养基与培养方式 1、培养基：MS， White , Morel等 2、培养方式：一般采用半固体培养基。
（四）影响茎尖脱毒效果的因素（茎尖脱毒技术 的关键）
植物种类、病毒种类、剥离茎尖的大小（0.30.5mm带1-3个叶原基）、培养基营养
•应用植物脱毒技术意义 • 植物脱毒技术可使植物恢复原来优良特 性，生长势增强，明显提高产量、改善品质， 产量的提高幅度最高可达300%。 • 植物脱毒技术不仅脱除了病毒，还可以 去除多种真菌、细菌及线虫病害，使种性得 以恢复，植株生长健壮，减少肥料和农药施 用量，降低生产成本，保护了环境
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消毒方法是：剪取顶芽梢段3、5厘米，剥去大 叶片，用自来水冲洗干净，在75%酒精中浸泡30秒 左右，用1%-3次氯酸钠或5%-7%的漂白粉溶液消 毒10-20分，最后用无菌水冲洗材料4-5次。
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• •酒精擦拭手
•外植体消毒
•浸泡5min
•器械消毒
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羽毛状花叶病毒 0.3～1.0
剥离茎尖大
植物 病毒名称
小
（mm）
百合 花叶病 0.2～1.0
鸢尾 花叶病 菊花 各种病毒 康乃馨 各种病毒 大丽花 花叶病 大蒜 花叶病毒 甘蔗 花叶病 草莓 各种病毒
0.2～0.5 0.2～1.0 0.2～0.8
0.6 0.3～1.0 0.7～3.0 0.2～1.0
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• 全世界已发现植物病毒有近788种。 病毒的危害：
• 组织和细胞病变 • 新陈代谢等生理机能受到干扰 • 外观表现不正常状态 • 由于危害可通过营养体传给后代，病毒对寄 主植物可造成毁灭性危害，导致大幅度减产， 甚至全株死亡。世界作物生产中，病毒危害程 度仅次于真菌。
2、热空气处理脱毒法 将植物用35～40℃的热空 气处理2～4周或更长时间。 特点：损伤较小，操作简便，须严格控制温度时间
适用：多数植物
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•3、热处理结合茎尖培养脱毒 • 目前常采用将热处理和茎尖分生组织培养结合 起来的方法脱毒。 •特点：既可缩短热处理时间，提高植株成活率， 又可剥离较大的茎尖，提高茎尖培养的成活率和脱 毒率。 •适用：大多数植物，并可除去一般培养难以去除 的纺锤块茎类病毒
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二、热处理脱毒 脱毒原理
即热处理脱毒，一些病毒对热不稳定，在高于常温 的温度下（35-40度）即钝化失活。
1、温汤浸渍处理脱毒法 材料置于50℃左右热水中 浸渍几十分钟到数小时。