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体内药物分析方法的建立与验证
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第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
(一)检测条件的筛选
标准物质 —— 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定 —— 确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度 HPLC —— 调整检测器(类型、条件) 色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度) 流动相(组分及其配比)及其流速 柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等 —— 使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ) 良好的色谱参数(n、R、T) 适当的保留时间(tR)
药物的萃取回收率等各项技术指标
——同时进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的 其他药物对测定的干扰程度,即方法特异性
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第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
色谱分析法
——进一步考察待测药物(或内标物)与内源性物质(或其它药物)的
分离情况
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第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
1.空白溶剂试验
待测药物的非生物基质溶液(通常为水溶液) ——采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等 样品预处理(反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等) ——测定响应信号(如HPLC峰面积或峰高) 考察目标 ——方法的特异性 ——空白值应尽可能小,并能有效校正
实际生物样品——确立分析方法后,尚需进行实际生物样品的测试
考察目标 ——代谢产物对药物、内标物质的干扰情况 ——进一步验证方法的可行性
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第四章 分析方法的建立与验证
第三节
分析方法 验证的内容与要求
用于实际生物样品分析之前 ——验证 (validation) 分析方法的可行性与可靠性 方法验证时应考虑影响分析方法 ——所有可变因素(采样,样品制备,色谱分离,检测与数据评价等) 使用的技术指标 ——效能指标 使用的样品
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第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求
一、方法特异性(专属性或选择性)
方法的特异性(specificity) ——又称专属性或专一性,通常与选择性(selectivity)互用
——系指当有内源性物质存在时,方法准确测定待测物质的能力
专属性——表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的 选择性——系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区 分(分离)的能力 特异性——函盖二者,以验证所测定的物质与待测药物的同一性
——代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定 ——采用LC-MS、EIA等分析检测技术
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第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据
二、分析测定的目的与要求
体内药物分析的目的——影响分析方法的应用
药代动力学——研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程
——血浆浓度随时间的变化过程;代谢途径及代谢产物 要求 ——同时测定原形药物和代谢产物
考察一个分析方法是否具有特异性,应着重考虑以下几点:
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第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求
1. 内源性物质的干扰
比较——待测药物或其活性代谢产物检测信号 对照品(或标准品) 空白生物基质 模拟生物样品(空白生物基质中添加对照品)
——如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 是否一致
二、分析方法的建立
初步拟定分析方法后 进行一系列试验工作——选择最佳分析条件
同时验证分析方法的可行性——确认是否适用于实际生物样品
分析方法的建立和验证过程——是不可截然划分的 ——为便于讨论而分别叙述
分析方法的建立步骤
第一步:检测条件的筛选 第二步:分离条件的筛选
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第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
色谱分析法
——可通过改变反应条件、萃取方法或萃取条件(萃取溶剂的 极性、混合溶剂的配比,固相萃取填料性质、冲洗剂与洗脱剂及其用 量等),甚至检测器类型 ——空白试剂信号应不干扰药物的测定(如R>1.5) 本步骤主要考察 ——需经化学反应的预处理过程,若预处理过程仅为生物样品 的提取分离,则可不进行该步骤,直接进行空白生物基质试验
及与内源性物质色谱峰的 R 确证——内源性物质对分析方法有无干扰
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第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求
2. 代谢产物的干扰
比较——模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号 与代谢产物(在实际样品中 tR 随时间延长而增加)的 R
如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 〔或改变色谱条件(色谱柱)再比较〕
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第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求
验证的效能指标与基本要求
1.特异性——避免干扰 2.标准曲线与线性范围——覆盖所有浓度范围 3.准确度——与实际状况相符 4.精密度——结果可重现
5.定量限——达到峰浓度的1/10~1/20
6.稳定性——确保所有样品准确测定 7.提取回收率——确保准确度
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第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
2. 空白生物基质试验
空白生物基质 (blank biological matrix) ——如空白血浆 ——照 “1. 空白溶剂试验” 项下方法操作 考察目标
——生物基质中内源性物质对测定的干扰(方法特异性)
——色谱峰的 tR、n 和 T 是否与水溶液的一致 色谱峰是否为单一成分 标准曲线的截距是否显著偏离零点等 ——内源性物质是否对待测药物或内标物质构成干扰
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第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
4. 实际生物样品的测试
空白生物基质和模拟生物样品试验——确定的分析方法及其条件 ——不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定 ——药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物) 或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物)
确证——其它代谢产物对分析方法有无干扰 结构已知的特定活性代谢物的测定 ——必要时通过HPLC-DAD和LC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性 对于结构未知的代谢产物的测定
——可采用LC-LC-NMR进行结构的初步推测后,考察其干扰情况
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——通常采用模拟生物样品和用药后的实际生物样品
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第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求
验证步骤
首先为分析方法的验证
——特异性、精密度与准确度、回收率
定量限与检测限、溶液稳定性
其次为生物基质中待测药物稳定性的验证
——室温放臵、冷冻(或冷藏)、冻-融循环
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第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据
三、生物样品的类型与预处理方法
生物样品的类型与预处理方法——决定分析方法的应用
以血浆或血清为分析样品 采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术 ——分析样品较为“干净”,可用HPLC检测 用RIA分析 ——样品的预处理方法可较为粗放 ——经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定
——在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗” (信号附近的有限范围)内不应出现内源性物质信号
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第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
3. 模拟生物样品试验
模拟生物样品(质量控制,QC样品)——空白生物基质中加入待测药物 ——照 “1. 空白溶剂试验” 项下方法操作 考察目标 ——方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度
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第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据
(一)待测药物的理化性质
药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等——预处理及检测方法 具有亲脂性——在适当的pH值下用溶剂萃取 具有强极性或亲水性——沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或 衍生化后萃取等 具有挥发性——GC测定法 具有光谱或电化学特性——分析检测方法 药物的稳定性——萃取浓缩技术 对酸碱不稳定——避免使用强酸或强碱性溶剂
二、分析测定的目的与要求
临床治疗药物监测 有效治疗浓度范围内药物浓度
方法——尽量简便、易行;适用于长期、批量样品的测定
——大多采用UV、RIA或EIA等
中毒患者的临床抢救 药物浓度极高
方法——不必强调方法的灵敏度,强调方法的特异性和分析速度 ——大多采用色谱及其联用技术GC、GC-MS、RIA或EIA
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第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
二、分析方法的建立
分析方法建立之前
Байду номын сангаас
查阅文献资料——充分了解药物在体内的动力学过程,使所 拟定的分析方法 ——避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定
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第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
一、分析方法的选择
二、分析方法的建立
(一) 检测条件的筛选 (二) 分离条件的筛选
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第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤