实验一蛋白质分子的测定─凝胶层析法一、实验原理
凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。
将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，小分子可以进入凝胶内部，流苏缓慢，一直最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得以分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，其内部都具有很微细的多空网状结构。
凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（Sepharose），人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel-P）和葡聚糖凝胶（Sephadex G）。
其中葡聚糖凝胶是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。
Vt由V o，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+V o。
V o为“孔隙体积”、“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积；Vg为凝胶本身体积；Ve为洗脱体积，即自加入样品时算起到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积，Ve与V o及Vi之间的关系为：Ve=V o+K d Vi，；K d为样品组分在二相间的分配系数，Kd=(Ve-V o)/Vi，有效分配系数为Kav，Kav=(Ve-V o)/(Vt-V o)。
在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析的特点，与一般层析方法不同。
Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。
Ve与分子量的关系为：Ve=K1-K2logM，K1与K2为常数，M为分子量，通常用Kav代替V e，建立标准蛋白质分子式量LgM与Kav的标准曲线，称为“选择曲线”。
在允许的工作范围内，曲线越陡，则分级越好，而工作坊为越窄。
凝佼层析主要决定于溶质分子的大小，每一类型的化合物，如球蛋白类，右旋糖酐类等都有它自己的特殊的选择曲线，可用以测定未知物的M r，测定时以使用曲线的直线部分为宜。
二、试剂材料
[试剂]
1、标准蛋白质：蓝色葡聚糖（分子式量200000），牛血清蛋白（分子式量67000），胃蛋白酶（分子式量36000），CytC(分子式量13700)。
2、洗脱液：0.2mol/L Tris-HCl-KCl，pH7.5
3、Sephadex G-75。
[器材]
1、层析柱：柱管1.0×40cm。
2、紫外分光光度计。
3、部分收集器。
4、刻度试管。
三、实验步骤
[1] 凝胶装柱：先将洗脱液缓慢导入柱管内，然后将处理好的凝胶溶液加入层析管中。
等到凝胶层胶面快接触到管顶端时，将洗脱管接好，洗脱30分钟，直到凝胶柱稳定。
[2] 调试液滴速度：将洗脱液速度调节至每分钟17滴，将时间定在3.0分钟自动调换试管，为加样收集洗脱液做准备。
[3] 加样：当液滴速度稳定在17滴每分钟之后，将层析管打开，用胶头滴管吸走多余的洗脱液。
此时将蓝色葡聚糖沿管壁加入凝胶层，同时用夹子夹住洗脱液出口，当葡聚糖加完之后，松开夹子，记录蓝色葡聚糖达到层析管低端的时间，此时收集的洗脱液体积即为V o，V o=V eI。
此时用夹子夹住洗脱液出口，重复上述步骤，添加牛血清蛋白质。
按照上述方法将4种标准蛋白质样本依次加入层析管中层析。
需要注意的是，需记录每次加样的试管号，以便计算各种物质的洗脱液体积，以后每加一种蛋白质的时间都要比上一种蛋白质添加时间间隔长；用分光光度计测定各试管洗脱液吸光度值，标出各个峰值，第二次加样到第二个峰值出现的各试管洗脱液的体积即为V eII，第三次加样到第三个峰值出现的各试管洗脱液的体积即为V eIII,第四次加样到第三个峰值出现的各试管洗脱液的体积即为V eIV。
[4]记录上述试验各部实验数据，建立有效分配系数Kav和洗脱液Ve标准曲线。
四、实验结果
实验过程中，记录实验试管编号和每个试管的洗脱液体积，以及相对应的吸光度值如下表所示：
表1 凝胶层析实验原始数据
试管编号单管洗脱液体积/ml 洗脱液总体积/ml A280nm
1 4.5 4.5 0.052
2 3 7.5 0.089
3 3 10.5 0.081
4 3 13.
5 0.061
5 3 16.5 0.252
6 3 19.5 0.137
7 3 22.5 0.040
8 3 25.5 0.023
9 3 28.5 0.023
10 3 31.5 0.016
11 3 34.5 0.188
12 3 37.5 0.135
13 3 40.5 0.071
14 3 43.5 0.041
15 3 46.5 0.032
16 3 49.5 0.022
17 3 52.5 0.020
18 3 55.5 0.027
19 3 58.5 0.040
20 3 61.5 0.103
21 3 64.5 0.036
22 3 67.5 0.012
23 3 70.5 0.014
24 3 73.5 0.013
25 3 76.5 0.017
26 3 79.5 0.017
27 3 82.5 0.023
28 1.8 84.3 0.036
29 3 87.3 0.035
30 3 90.3 0.023
31 3 93.3 0.007
32 3 96.3 0.007
33 3 99.3 0.006
34 3 102.3 0.010
35 3 105.3 0.018
36 3 108.3 0.090
37 3 111.3 0.237
38 3 114.3 0.251
39 3 117.3 0.172
40 3 120.3 0.087
41 3 123.3 0.034
42 3 126.3 0.024
利用Excel2003绘制洗脱液总体积—吸光值散点图，见图1。
和实验操作一样，有4个峰值，分别为蓝色葡聚糖、牛血清蛋白、胃蛋白和CytC。
从中可知，V0=V eI=16.5ml，V eII=34.5ml，V eIII=61.5ml，V eIV=114.3ml。
图1 凝胶层析洗脱液体积与对应吸光度值散点图
建立标准蛋白Ve与与LogM标准曲线，见表2、图1。
相关系数R2 = 0.9267，相关性较好，可作为为测定未知蛋白的标准曲线。
因此最终的标准曲线为：Ve= -84.062·LogM+452.21。
表2 各标准蛋白V e与logM值
蛋白质种类葡聚糖牛血清胃蛋白CytC
V e16.5 34.5 61.5 114.3
logM 5.301 4.826 4.556 4.137
图2 蛋白质V e与LogM的线性图
五、分析与讨论
[1] 在允许的工作范围内，曲线越抖，则分级越好，本实验选择曲线
斜率为-84.062，曲线很陡，说明此蛋白质的分级很好。
[2] 从洗脱液总体积—吸光值散点图（图1）看，除了4个标准品的
峰外，在葡聚糖之前、胃蛋白和CytC之间均出现了很小的波峰，干扰实验结果分析。
出现这种情况的原因可能是加样不均匀或者仪器本身不稳定等。
[3] 实验的误差原因及注意事项有:凝胶干粉要充分溶胀；层析柱粗
细要均匀；连续用的小乳胶管不能有破损；实验过程中要保持层析柱液面水平；加样的浓度和粘度要适中；洗脱用的液体应与凝胶溶胀所用液体相同；收集的溶液体积测量要准确等。