• 葡萄糖异构酶——世界上生产规模最大的一种固定化酶。
• 用吸附法、结合法、凝胶包埋法等进行固定化。
•
•
葡萄糖异构酶
• 葡萄糖
果糖
果葡糖浆（是由植物淀
粉水解和异构化制成的淀粉糖晶）
固定化酶在工业生产中的应用
• 聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆菌菌体， 制得固定化延胡索酸酶。工业化生产L-苹果酸
三 酶解注意要点
• 2 酶系选择：
• 细菌和放线菌-肽聚糖-溶菌酶 • 霉菌-纤维素、几丁质-蜗牛酶 • 酵母菌-葡聚糖、几丁质- β葡聚糖酶 • 植物-纤维素、半纤维素、果胶-纤维素酶和果胶酶
• 3 酶浓度选择（0.5%-1%）
三 酶解注意要点
• 4 酶解温度和pH • 5 酶解终点确定
• 低渗爆破法-显微镜下观察原生质体在低渗溶液中吸水膨胀、破裂的 过程，反应终点应没有残骸。
细胞固定化方法
• 吸附法 • 包埋法
吸附法
• 它主要通过载体与细胞间的静电引力， 即细胞表面与载体之间范德华作用力， 离子键和氢键作用力，才使细胞固定 在载体上的。
影响吸附法的主要因素
• （1）Z-电位： Z-电位能近似地代表表面电荷 密度的大小
• （2）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的 电荷性质
除去啤酒中的溶解氧和瓶颈氧，
葡萄糖氧化酶 阻止啤酒的氧化变质。
LLS催代酶
•加快双乙酰形成和还原 •降低双乙酰含量、缩短啤酒生产周期 •避免包装后双乙酰的回升。
固定化酶在工农业生产上的应用
产物
L-氨基酸 果糖浆
6APA L-门冬氨酸 L-苹果酸 低乳糖牛奶 乳糖 干蛋白 果汁脱苦 啤酒 植物白脱 脂肪酸
• 微生物、植物和动物细胞固定化
• 细胞特性比较
细胞种类 细胞大小/um 倍增时间/h
营养要求 光照要求 对剪切力
植物细胞 20-300 >12 简单
大多数要光照 敏感
微生物细胞 1-10 0.3-6 简单
不要求 大多数不敏感
动物细胞 10-100 >15 复杂 不要求 敏感
主要产物
色素、药物、香 精、酶等
• 常用凝胶包埋法 • 通过多价离子使高分子电解质形成凝胶的包埋
法，其中尤以海藻酸钙包埋法最为常用，由于 所用的试剂没有毒性，包埋的细胞易于增殖， 故常被优先选用于生长细胞，以及某些敏感细 胞（如植物细胞）和原生质体的包埋。
举例海藻酸钙包埋法
• 基本原理是：称取一定量的海藻酸钠配成水 溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的细胞或 孢子悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管 将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中（常用 CaCl2 溶液），形成球状固定化细胞
要点：如何保护细胞内部的结构完整性，防止制备得到的原生质体 的破裂
策略： 专一的酶
加入适当的渗透压稳定剂
三 酶解注意要点
• 1 酶解前要预处理：主要是为了使酶渗透到细胞器中去。 • 采取的策略：先加入物质抑制或阻止某种细胞壁的成分
合成，可以使酶插入。 • 一般加入：巯基乙醇，Triton-100,甘氨酸、青霉素。
• 采用聚砜中空纤维膜反应器固定淀粉酶可控制淀粉水 解，制备糊精。
反应器选择
• 酶的形式： 溶液酶
•
颗粒状或片状固定化酶
•
膜状和纤维状固定化酶
• 底物的物理性质：溶解性、颗粒物质和胶体物质
• 反应操作要求
• 酶的稳定性
• 应用和可塑性和成本
酶反应器的应用-控制液态流动方式
• 反应器中流动方式的改变会使酶与底物的接触不 良，造成反应器生产能力降低。
醇、有机酸、氨基 酸、抗生素、核 苷酸、酶
疫苗、激素、 抗体、酶
固定化细胞的特点
• 类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞
• 生理状态：死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器）
•
活细胞（增殖细胞、静止细胞）
• 形状：颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。
•
最多使用：颗粒状珠体
• 使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞 原有的全部活性， 只要载体不解体，不污染就可以
• 荧光染色：发出红色则为完全原生质体，发出绿光还有细胞壁成份。
四 稳定剂（高渗溶液）要求
• 1 加入的化合物对细胞和原生质体无毒性 • 2 不会影响水解酶的活性 • 3 对代谢产物无不良影响
四 稳定剂加入操作注意点
• 1 一定pH （酶和菌体质体易脱水皱缩）
损失。
填充式反应器
床内用颗粒状或片状 固定化酶填充，运转 时，底物按一定方向 以恒定速度通过反应 床。使用最普遍.
流化床反应器
底物溶液以足够大的流速 向上通过固定化酶床层， 使固体颗粒处于流化状态。 混合程度高，故传热、传 质情况良好。可用于处理 粘性强和含有固体颗粒的 底物，或用于需要供应气 体或排放气体的反应。
糖化酶： 将淀粉水解为葡萄糖，提高发酵度， 生产干净爽快的干啤酒
3、发酵过程中添加的酶制剂
真菌淀粉酶
•将未分解的 部分淀粉和 糊精降解
•提高发酵度 •降低冷浑浊
溶菌酶
α-乙酰乳酸脱羧酶
•破坏细菌胞壁
•对酵母等真核 细胞没有影响
•降低双乙酰 峰值
•缩短发酵时间
4、
后 酵 过 程 中 添 加 的 酶 制 剂
酶反应器和固定化酶（细胞）的应用
• • 酶反应器介绍
• 酶反应器的选择和应用
• 固定化酶和细胞的应用
生物催化反应器工程
通过反应器型式、操作方式的改变能 否使生物催化反应效率最大化？
将反应与传质紧密相关
实验室酶反应器
固定化酶反应器
一．酶反应器。
•
分批搅拌反应器
• 搅拌罐型
•
连续流搅拌桶反应器
植物细胞（组织）培养
悬浮细胞培养 收集细胞
提取纯化 产物
药物制剂
动物细胞（组织）培养
生长特点：
（1）贴壁生长：培养瓶中的悬浮液细胞，紧 贴培养瓶内壁才能生长
（2）接触抑制：当培养瓶中内壁生长细胞彼 此紧密接触时，细胞不再分裂
比较动植物细胞培养
原理
细胞来源
状态
培 养
成分
基 组成
器皿 过程
生长特点
• 一 原生质体固定化的方法
• 制备原生质体——将原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲 液中配成原生质体悬浮液——包埋法固定化原生质体。
• 优点： 除去细胞壁-增加细胞膜的通透性
•
增加载体-较好的操作稳定性和保存稳定性
•
利于产物的分离纯化
• 关键：原生质体如何制备？
二 原生质体的制备
• 将对数生长期的细胞收集——悬浮在含有渗透压稳定剂 的高渗缓冲液中——去细胞壁——分离纯化——得到原 生质体-活性鉴定
• （3）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机 材料
包埋固定法
• 包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生 化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合 物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。
• 包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内 多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行 产物的发酵生产。
包埋法分类
• 常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、 聚丙烯酰胺
长期使用。
固定化细胞的优点：
1、可增殖，细胞密度大，可获得高度密 集而体积小的生产菌集合体。
2、发酵稳定性好，可以较长时间反复 使用或 连续使用
3、发酵液中含菌体较少，有利于产品 分离纯化。
4、有利于需要辅酶和多酶系统才能进 行的反应。
概念：
固定化细胞是指直接将细胞固定 在水不溶性载体上，在一定的空 间范围内进行生命活动（生长、 繁殖和新陈代谢）的细胞。
诱导形成愈伤组织，细胞增 殖分化
细胞进行异养需氧代谢
恒温、无菌、无需光照
常温、无菌、光照条件
细胞株→细胞系
愈伤组织→植株
固定化细胞的目的
• 微生物菌体：不需多次培养、扩大，从而缩短了发 酵生产周期，细胞密度大，可增殖。
• 植物细胞：减轻剪切力，避免聚集成团 • 动物细胞：贴壁的优势
固定化原生质体
培养条件 培养结果
动物细胞培养
植物细胞培养
细胞的增殖
细胞的全能性
胚胎或幼龄动物组织或器官 离体植物器官、组织或细胞
液体
固体
天然培养基
合成培养基
葡萄糖、氨基酸、无机盐、 矿质元素、蔗糖、维生素、
维生素、动物血清
植物激素、有机添加物
培养瓶
锥形瓶
原代生长，传代生长
更换培养基，细胞增值分化
贴壁生长，细胞增殖不分化
原料
乙酰-DL-氨基 酸 葡萄糖 青霉素G 反丁烯二酸 反丁烯二酸 牛奶 牛奶 蛋白 桔类果汁 生啤酒 植物油 植物油
产物
类固醇 L-丙氨酸
酶或细胞
氨基酰化酶 葡萄糖异构酶或含该酶之菌体 青霉素酰胺酶 含有门冬氨酸的菌体 含有反丁烯二酸酶的菌体 乳糖酶 碱性蛋白酶 葡萄糖氧化酶和氧化氢酶 柚苷酶 木瓜蛋白酶 脂肪酶 脂肪酶
固定化方法
载体结合法 载体结合法或交联法 载体结合法 胶格包埋法 胶格包埋法 载体结合法 载体结合法 胶格包埋法 载体结合法 载体结合法或包埋法 胶格包埋法 载体结合法
• 流动方式改变造成反混程度的变化，会发生程度 不同的反应或副反应。
• 物料粒子进入反应器后所经历的时间称为粒子的 年龄。粒子离开反应器时的年龄称为停留时间。
• 反应器内不同年龄的粒子间的混合称为返混。
酶反应器的应用
• 保持酶反应器的稳定性： • 防止酶变性、中毒、自溶或载体磨损。
• 防止酶反应器中微生物污染 • 向底物中加入杀菌、抑菌物质，或有机溶剂 • 底物物料预先除菌 • 在45度以上环境中或酸、碱缓冲液中进行反应 • 酶反应器每次用后消毒