生物化学实验指导书生物化学教研室2011、2、1目录实验须知实验内容实验一蛋白质的两性电离和等电点的测定实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验三血清总蛋白测定（双缩脲法、Folin—酚法）实验四 PH与温度对酶活性的影响实验五激活剂和抑制剂对酶活性的影响实验六酶的特异性实验七琥珀酸脱氢酶活性的抑制实验八分光光度计的使用实验九血糖的测定（葡萄糖氧化酶法）实验十肝中酮体生成作用实验十一血清胆固醇测定（酶法）实验十二 ALT的测定实验十三血红蛋白与核黄素的凝胶柱色谱分离实验十四肝组织核酸的提取、分离和鉴定实验十五血清尿素氮的测定实验十六血清胆红素测定实验十七：总糖的测定---蒽酮比色法实验十八：饥饿与饱食对肝糖元含量的影响实验十九：乳酸脱氢酶活力测定生物化学实验须知一、实验目的1．培养学生科学的思维方法和学习作风，独立工作能力。

2．学习基础生物化学实验方法，为今后的学习与研究准备更好的条件。

3．培养学生爱护国家财物、爱护集体、团结互助的优良道德品质。

4．培养学生的书面及口头表达能力。

二、实验的总要求1．按教研室予先公布的实验进度表，了解各次实验的具体内容，并认真做好预习。

弄清各步骤的意义，避免教条或机械式做实验。

未预习者不得进实验室。

2．进行实验不仅要求结果良好，而且要求敏捷高效。

一切步骤都按正规操作方法进行；样品与试剂勿过量取用；注意力集中，避免差错。

3．实验中观察要仔细，记录要详尽、及时与客观。

无论实验成功与失败，都应直接记录在实验报告本中，不得于实验后追记。

对于失败的实验，要分析其原因。

4．实验室是集体学习与工作的场所，实验时应保持肃静，不得大声喧哗，以免影响他人的工作与思考。

5．注意保持实验室内的整洁。

实验用器具、试剂等应排列整齐有序。

实验时切勿将试剂、标本溅洒于实验台面、地面及衣物上，如果有溅出应及时处理。

实验后应清洗用过的仪器及清理自己的实验场所。

实验所用的器材、设备不得随意乱动。

实验室内的一切器材物品严禁携出。

6．实验时使用水、电、火、易燃易爆试剂、化学毒剂及传染标本等应注意安全，防止燃烧或爆炸，防止中毒等事故之发生。

7．对师长尊敬，对同学要团结友爱。

三、实验报告实验报告的书写是培养学生书面表达能力和科学作风的重要手段之一，实验者应该重视。

实验报告的内容包括下列各项：实验名称、实验日期、实验目的、实验原理、实验步骤，实验记录、计算、讨论或小结。

实验记录应包括随做随记的原始记录。

书写实验报告要字迹工整，语句通顺。

书写工整的实验报告，是尊师的重要表现之一。

四、组织与分组1．每一实验室推选一名学生课代表，负责下列工作：①实验报告的收集与分发；②安排清扫值日名单；③反映同学学习情况及对教学工作的意见；④其它临时性的工作。

2．一般每个学生单独进行实验。

有的实验要两人一组，由相邻两学生组成固定小组。

小组的成员在指导教师的同意下，可作适当的调整。

五、仪器1．每次实验前，实验者应根据本实验使用的仪器种类与数目，检查分发在实验桌上的各种仪器，如有缺损应于清洗前立即向准备室负责老师补换。

实验中如有破损，则必须登记，按学院规定处理。

实验后应将完整仪器洗涤清洁，点交管理人员。

2．公用仪器（包括贵重仪器，如分光光度计、电动离心机等）使用时间不宜过长，以免妨碍他人工作。

设有使用登记薄的仪器，使用后必须登记，以示负责。

对于不熟悉之仪器，应请教师指导，切勿随意乱动。

六、试剂1．每2~6人合用一份试剂。

在一般情况下，使用的试剂应该固定。

2．取试剂瓶塞与量取用具（如吸管或滴管）不应分开，用后应立即放回原处，量取用具应按规定放置。

瓶塞与量具一旦弄错，试剂即受损坏、污染，实验就可能失败。

3．标准试剂不应用潮湿之吸管与之直接接触，取出后不得再放入原瓶。

七、玻璃仪器的洗涤一般玻璃仪器用肥皂或去污粉以毛刷洗涤即足以满足要求，洗后应将肥皂或去污粉仔细冲掉，将水倾去后，器壁不挂水珠，视为合格。

铬酸洗液仅用于毛刷不能洗净的仪器，切勿滥用普通玻璃仪器之洗涤。

使用铬酸洗液时，仪器应干燥；过多的水份将使洗液迅速失效。

用过之铬酸洗液须加以保存以反复使用，直至为绿色后方可舍弃；其舍弃法与浓硫酸液相同。

用洗液浸洗过的玻璃仪器，应先用自来水冲洗，然后再用蒸馏水或去离子水清洗，清洗时，宜采用“少量多次”原则以节约蒸馏水，同时清洗的效率也高。

八、舍弃物的处理舍弃物必须依照其性质作适当的处理。

以免造成实验材料的浪费，损坏水槽及下水管道，或污染实验环境。

1．所有固体舍弃物（例如用过的滤纸、损坏的软木塞及橡皮物、玻璃渣、火柴梗等）。

必须放入废物筒或篓中，切勿丢入水槽中。

2．废硫酸或洗液，应先倾入大量水中，再倒入水槽中，并以大量水冲走。

3．实验完成后的沉淀或混合物，若含有可提取或收回的贵重物品者，不可随意舍弃，应放入教师指定的回收器中。

实验一：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验目的：1. 掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的方法及实验原理。

2. 了解血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的临床意义及影响因素。

实验原理：带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。

血清蛋白质的等电点均低于pH7.4，因此，在pH比其等电点高的缓冲液中它们都电离成负离子，在电场中都会向正极移动。

因各种血清蛋白质等电点不同，在同一pH下所带电荷数量不同，加上分子量的差别等因素，它们在电场中的运动速度就不同。

蛋白质分子小而带电荷多的运动较快；分子大而带电荷少的运动较慢。

所以可利用电泳将血清蛋白质按其在电场中运动的速度快慢分为白蛋白、α1－球蛋白、α2－球蛋白、β－球蛋白及γ－球蛋白等五条区带。

可用分光光度法定量检测出五种蛋白质的含量和百分数，也可将染色后的膜条直接用光密度计测定。

实验器材：【仪器】1．试管、试管架、吸量管2．电泳仪：包括直流电源整流器和电泳槽两个部分，电泳槽内装有两个电极（用白金丝制成）。

3．醋酸纤维薄膜（2.5×8㎝）：【试剂】1．pH8.6，离子强度0.075的巴比妥缓冲液：巴比妥钠15.45g，巴比妥2.76g，蒸馏水700～800 ml，加热溶解，冷后补足蒸馏水至1000ml。

2．氨基黑10B染色液：氨基黑10B 0.5g，甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸馏水40ml，混合使溶解。

3．漂洗液：甲醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，混匀，分装甲乙丙三瓶备用。

4．新鲜血清5．0.4mol/L氢氧化钠溶液6．透明液：冰醋酸25ml，无水乙醇75ml，混匀备用。

实验内容与方法：1.电泳槽的准备：将缓冲液加入电泳槽的两槽内，并使两槽液面在同一水平。

两槽内侧边各贴挂四层滤纸或纱布，浸入缓冲液中构成盐桥。

2．薄膜的准备与点样：取2.5×8cm的膜条（1）薄膜有光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透下沉，约浸泡10－20分钟，即膜条无白斑时。

（2）将充分浸透的膜条取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，于薄膜的无光泽面距一端1.5cm处作为点样线。

（3）用点样器在盛有血清的表面血中蘸一下，点样器下端粘上薄层血清，然后将点样器竖直，使其沾有血清的顶端紧贴在薄膜点样线上，待血清全部渗入膜内后，移开点样器，注意点样的两端不可到边。

2．电泳：将点样后的膜条置于电泳槽的盐桥上，放置时膜条无光泽面（即点样面）向下，以防薄膜干燥，点样端置于负极，槽架上以四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧。

盖好电泳槽的盖，待平衡5分钟后，即可通电。

调节电泳仪，使两极间距（指膜条与滤纸桥总长度）的电压为8～10V/cm长，或电流0.4～0.6mA/cm宽，通电50分钟左右关闭电源。

3．染色与漂洗：通电完毕后，用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染3分钟取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液甲、乙、丙三瓶中各漂洗5'，直至背景漂净为止。

用滤纸吸干薄膜，即得五条蛋白区带，从阳极至阴极端依次为白蛋白、α1－球蛋白、α2－球蛋白、β－球蛋白及γ－球蛋白，。

实验注意事项：1．点样是实验成功的关键，点样不可太多或太少。

2．电泳和漂洗时不要拿错膜条。

实验报告：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳思考题：血清蛋白质在pH8.6的巴比妥缓冲液中带什么电荷?它们泳动的先后顺序如何?为什么？实验二蛋白质两性电离与等电点的测定实验目的：1. 了解蛋白质两性电离与等电点的测定原理。

2. 熟悉蛋白质两性电离与等电点测定的操作方法。

3.培养学生严谨的作风和准确地进行实际操作的能力，提高分析问题的能力。

实验原理：蛋白质是两性电解质,其电离过程取决于溶液的PH值。

若当PH大于蛋白质的PI时，蛋白质带负电荷，不易沉淀。

反之，当PH小于蛋白质的PI时，蛋白质带正电荷，也不易沉淀。

当溶液处于某一PH值时，蛋白质所带的正、负电荷数量相等，净电荷为零，呈兼性离子状态，此时溶液的PH值称为这种蛋白质的等电点（PI）；这时的蛋白质在电场中既不向负极也不向正极移动；溶解度最低，容易析出。

所以当溶液处于PI时，沉淀最多。

实验器材：【仪器】试管、试管架、吸量管【试剂】⒈ 5g/L酪蛋白醋酸钠溶液: 称取纯酪蛋白0.5g，加蒸馏水40ml及1.00mol/L氢氧化钠溶液10.0ml，振摇使酪蛋白溶解，然后加入1.00mol/L醋酸溶液10.0ml，混匀后倒入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀。

2．0.1g/L溴甲酚绿指示剂：该指示剂变色范围为PH 3.8－5.4。

酸色型为黄色，碱色型为蓝色。

3．0．02mol/L盐酸溶液4．0．02mol/L氢氧化钠溶液5．1.00mol/L醋酸溶液6．0.1mol/L醋酸溶液7．0.01mol/L醋酸溶液实验内容与方法：一. 蛋白质两性电离实验1．取试管一支，加入5g/L酪蛋白醋酸钠溶液0.3ml，0.1g/L溴甲酚绿指示剂1滴，混匀，观察溶液呈现的颜色。

2．用乳头滴管缓慢滴加0．02mol/L盐酸溶液，随滴随摇，直到有明显的大量沉淀发生。

观察溶液颜色的变化。

3．继续滴入0．02mol/L盐酸溶液，观察沉淀与溶液颜色的变化。

4．再滴入0．02mol/L氢氧化钠溶液，随滴随摇，使之再度出现明显的大量沉淀，再继续滴入0．02mol/L氢氧化钠溶液，沉淀又溶解，观察溶液颜色的变化。

二酪蛋白等电点的测定：1．取试管5支，按下表操作：加入物（ml） 1 2 3 4 5 蒸馏水 1.6 － 3.0 1.5 3.381.00mol/L醋酸溶液2.4 －－－－0.10mol/L醋酸溶液－ 4.0 1.0 －－0.01mol/L醋酸溶液－－－ 2.5 0.625g/L酪蛋白醋酸钠溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0溶液的最终PH 3.2 4.1 4.7 5.3 5.92．静置20分钟，观察各管沉淀出现情况。

并以“－、＋、＋＋、＋＋＋”记录沉淀多少。

实验注意事项：仔细观察并记录蛋白质两性游离实验中沉淀及沉淀消失的现象。