·1462· Chin Pharm J，2014 August，Vol. 49 No. 16
收入依诺肝素钠新版国家标准草案的鉴别项目中。
1 仪器与试药 LC － 20AD 型高效液相色谱仪（ 日本岛津公司，
包括：DGU － 20A3 脱 气 装 置； LC － 20AD 二 元 泵； SIL － 20AC 自 动 进 样 器； CTO － 10ASvp 柱 温 箱； SPD － 20A； UV 检 测 器； CBM － 20A 系 统 控 制 器； LC － Solution色谱工作站） 。
中国药学杂志 2014 年 8 月第 49 卷第 16 期
Chin Pharm J，2014 August，Vol. 49 No. 16 ·1461·
分子肝素有许多不同的种类，它们的相对分子质量 与相对分子质量分布、硫酸化程度、抗凝活性均不相 同。依诺肝素钠（图 1）是将肝素的苄基酯衍生物进 行碱裂解 β-消除而获得的一种低分子肝素，结构较 为复杂，其结构特点是多数糖链的非还原端有一个 4-吡喃糖醛酸的结构，有 15% ～ 25% 的糖链在其还 原端有特征双环结构（1，6 脱水葡萄糖和 1，6-脱水 甘露糖）［2］，还原末端的 1，6-脱水衍生物的双环结 构是其区别与其他品种低分子肝素的特征性指标。 1，6-脱水衍生物结构是解聚肝素生产依诺肝素过程 中副反应的产物，该结构不会增加其活性，还可能会 降低其与抗凝血酶的结合［3］，其含量可通过调整水 解过程中的碱的量和反应时间加以控制［4］。
硫酸化大部分发生在 C6，少部分在 C3 和 2 位氨基 上，艾杜糖醛酸和葡糖醛酸残基只有少部分在 C2 上硫酸化，乙酰化只发生在氨基葡糖的 2 位氨基上。 氨基葡糖 C3 上的硫酸化是结合抗凝血酶（ AT III） 所必需的［1］。
根据原料来源、生产工艺、末端结构的不同，低
基金项目：国家质量监督检验检疫总局公益性行业专项“双打”中药品检验检测技术方法研究，子课题《低分子肝素标准提高研究》资助项目
ABSTＲACT： OBJECTIVE To establish an HPLC method to determine the levels of the characteristic 1，6-anhydro derivatives of enoxaparin sodium. METHODS The enoxaparin sodium solution was depolymerized by a mixture of heparinases to obtaine di-or tetra-saccharide units，and the products were reduced by sodium borohydride and then analyzed by SAX-HPLC. The analysis was carried out on a Waters Spherisorb S5 SAX column （4. 0 mm × 250 mm，5 μm）. The mobile phase was composed of 0. 28 g·L －1 monobasic sodium phosphate solution （ A） and 140 g·L －1 sodium perchlorate solution （ B） （0 － 20 min，3% － 35% B；20 － 50 min，35% － 100% B；50 － 60 min，100% B；60 － 61 min，100% － 3% B，61 － 79 min，3% B） and the flow rate was 0. 8 mL·min －1. The column temperature was 50 ℃ and the detection wavelength was set at 234 nm. The normalized area percentage method was used for calculation. ＲESULTS One domestic heparinase factory was screened out that could pass the depolymerization suitability test，and the ratio of the peak area of 1，6-anhydro-ΔⅠS-ⅠS to that of 1，6-ΔⅠS was not more than 1. 15. In the optimal chromatographic condition，the resolution between reduced ΔⅠA and 1，6-anhydro-ΔⅠS was greater than 1. 5. The ratio of the peak area of ΔⅠS and reduced ΔⅠS of the reduced solution was less than 0. 02. The contents of 1，6-anhydro derivatives in the samples from two domestics factories were between 15% － 25% ． CONCLUSION This method can be used to separate and quantify the specific reduced end structures of enoxaprin. As the first test to analyze the LMWH’s structure，the method has already been included into the revised national standard draft for enoxaparin. KEY WOＲDS： enoxaparin； 1，6-anhydro structure； HPLC； heparinase Ⅰ，heparinase Ⅱ；heparinase Ⅲ；national standard
低分子肝素（ low molecular weight heparin，LMWH） 是酶解或化学裂解肝素后得到的产物，具有与 肝素相同的母体结构，即由双糖单位重复连接组成 的线性糖链。双糖单位是由糖醛酸［β-D-葡萄糖醛 酸（ G） 或 α-L-艾杜糖醛酸（ I） ］和 α-D-氨基葡糖（ GlcN） 通过 1 →4 糖苷键连接而成。氨基葡糖残基的
高效阴离子交换色谱法测定依诺肝素钠 1，6 - 脱水衍生物含量
王悦，李京，李颖颖，范慧红* （ 中国食品药品检定研究院，北京 100050）
摘要：目的 建立依诺肝素钠特异性末端结构 1，6-脱水衍生物结构的含量测定方法。方法 肝素酶混合液将依诺肝素钠水 解成二糖或四糖单位，水解得到的寡糖峰经硼氢化钠还原后用-高效阴离子交换色谱法方法进行分析。采用 Waters Spherisorb S5 SAX（4. 0 mm × 250 mm，5 μm） 色谱柱，以 0. 28 g·L － 1 磷酸二氢钠溶液为流动相 A 含 0． 28 g·L － 1 磷酸二氢钠及 140 g· L －1 高氯酸钠的溶液为流动相 B 进行梯度洗脱（0 ～ 20 min，3% ～ 35% B；20 ～ 50 min，35% ～ 100% B；50 ～ 60 min，100% B；60 ～ 61 min，100% ～ 3% B，61 ～ 79 min，3% B） ，流速 0. 8 mL·min －1 ，柱温为 50 ℃ ；检测波长为 234 nm，并用归一化面积百分比法计 算摩尔百分含量。结果 筛选出了酶解效果达标的国产肝素酶并优化了酶解条件，酶解后 1，6-脱水 ΔⅠS-ⅠS 与 1，6-脱水 Δ ⅠS 峰面积比 ＜ 1. 15；优化色谱条件后 ΔⅠA 和 1，6-脱水 ΔⅠS 的分离度 ＞ 1. 5；硼氢化钠还原后的溶液色谱图中，ΔⅠS 和还原 ΔⅠS 的峰面积比均小于 0. 02；两家国产依诺肝素钠生产企业样品结果均在 15% ～ 25% 内。结论 方法可对依诺肝素钠特征 还原末端结构进行分离和定量，作为对低分子肝素进行微观结构分析的首个鉴别项目，已收载入新修订依诺肝素钠国家标准 草案中。 关键词：依诺肝素钠；1，6-脱水衍生物；高效阴离子交换色谱法；肝素酶Ⅰ；肝素酶Ⅱ；肝素酶Ⅲ；国家标准 doi：10. 11669 / cpj. 2014. 16. 021 中图分类号：Ｒ917 文献标志码：A 文章编号：1001 － 2494（2014）16 － 1461 － 06
美国药典依诺肝素钠对照品（ 批号：GOL137，美 国药典 会）； 欧 洲 药 典 依 诺 肝 素 钠 对 照 品 （ 批 号： batch4，EDQM 公司） ； 双糖对照品分别购自 Sigma 公司（ ΔⅠA、ΔⅣA、ΔⅡS、ΔⅢS） 、Dextra 公司（ ΔⅡ A、ΔⅢA、ΔⅠS） 和 Santa Cruz 公司（ ΔⅣS） ；肝素酶 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 购自 Grampian Enzymes（ G） 、苏州国镝医 药科技有限公司（ D） 、北京思清源生物科技有限公 司（S）3 家公司；牛血清白蛋白为进口分装试剂；其 他试剂均为国产分析纯。

（2012104008） ；中国食品药品检定研究院中青年发展研究基金课题《低分子肝素质控对照品、标准试剂的制备及标化》资助项目（2012A5） 作者简介：王悦，女，助理研究员 研究方向：多糖类药物质量控制 * 通讯作者：范慧红，女，研究员 研究方向：生化药物的质量控制
Tel / Fax：（010）67095349 E-mail：shenghuayaoshi@ 126. com
对低分子肝素进行糖片段分析，需要将其降解 成基本组成单元，目前较为常用的方法为混合肝素 酶水解 后 （ 肝 素 酶 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，从 肝 素 黄 杆 菌 中 得 到） ，再用高效阴离子交换色谱分析。本实验的原 理即用混合肝素酶将依诺肝素钠水解成双糖为主的 寡糖片段（ 表 1） ，经硼氢化钠还原后，用阴离子交换 色谱法进行分析。酶解后的糖链主要生成 4 个含 1，6-脱水衍生物结构的片段：1，6-脱水 ΔⅡS、1，6-脱 水 ΔⅡSepi、1，6-脱水 ΔⅠS 和 1，6-脱水 ΔⅠS-ⅠS，酶 解后的寡糖由于其 α、β 异构体的存在，双糖 ΔⅡA 与 1，6-脱水 ΔⅡS、1，6-脱水 ΔⅡSepi 不能有效分离， 因此酶解后的样品还要经硼氢化钠还原。除 1，6脱水衍生物因含有 1，6 脱水环状结构，不被硼氢化 钠还原外，其余寡糖片段还原后消除了互变异构，保 留时间会提前，不被硼氢化钠还原的 4 个 1，6-脱水 衍生物的保留时间不变，ΔⅡA 与 1，6-脱水 ΔⅡS 和 1，6-脱水 ΔⅡSepi 峰可较好分离（1，6-脱水 ΔⅡS 和 1， 6-脱水 ΔⅡSepi 在目前的色谱条件下会共洗脱，以一个 色谱峰的形式被一起定量，为了简化表述，在下文中 将不再提及 1，6-脱水 ΔⅡSepi，而以 1，6-脱水 ΔⅡS 表 述） 。根据各寡糖片段的相对分子质量和峰面积，即 可计算出 1，6-脱水衍生物结构的百分含量。