蛋白质酪氨酸磷酸化-免疫沉淀及Wes tern印迹两种方法的比较*预防医学院放射生物实验室 陈沙力 刘树铮提 要 为了深入了解在细胞信息传递中蛋白质酪氨酸磷酸化研究的较佳方法,采用免疫沉淀法及Western 印迹法对电离辐射诱导的小鼠胸腺细胞蛋白质磷酸化进行了比较分析。
免疫沉淀结果表明,照射后17500、22000、28000、32000、40000、43000及53000蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。
Western 印迹结果表明,照射后28000、32000蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。
提示在蛋白质酪氨酸磷酸化的研究中,免疫沉淀法优于Western 印迹法。
关键词 蛋白质 磷酸化 免疫沉淀 免疫印迹中图号 R331 蛋白质酪氨酸磷酸化是多种刺激因素诱导激活基因表达的细胞信息传递通路中的基础步骤,也是电离辐射激活淋巴细胞PKC 信息传递通路及转录因子N F -kB 最基本的步骤〔1〕。
预先的研究表明,低剂量电离辐射可诱导小鼠胸腺细胞数种蛋白分子发生变化〔2〕,其中包括辐射刺激引起蛋白分子的甲基化、糖基化及磷酸化等化学修饰变化。
研究蛋白质磷酸化在细胞信息传递中的作用具有重要的意义。
本研究采用免疫沉淀及Western 印迹两种方法对辐射诱导的小鼠胸腺细胞蛋白分子磷酸化进行了比较研究,现将结果报告如下。
1 材料和方法1.1 动物及照射条件健康雄性昆明小鼠,体重18～22g 。
采用Philips 深部X 射线机照射动物,电压200kV ,电流10m A,滤板0.5mm Cu,1.0mm Al,靶皮距离212cm 。
单次全身照射,剂量率为12.5m Gy /min ,剂量为75m Gy 。
1.2 小鼠胸腺细胞分离及金黄色葡萄球菌Cow an I 株(SAC )的活化、纯化、鉴定、增殖、回收及处理 * 国家自然科学基金资助课题(39270207)参见文献〔3,4〕。
1.3 免疫沉淀 1.3.1 H 332PO 4代谢标记胸腺细胞及细胞裂解 用无磷酸盐RPM I 1640培养液(Sig-ma )调细胞浓度至107个/ml ,加入H 332PO 4(中科院原子能研究院)4.625×109Bq /ml,37℃平缓摇动培养3h ,冷生理盐水洗涤2次并溶解于细胞裂解液(50mmol /L Tris,p H 7.5,150mm ol /L Na Cl ,1%N P -40,0.1mol /L NaF ,10mm ol /L Na 3VO 4,5mm ol /L EDT A,1mmol /L PM SF ,2U Aprotinin )中,冰浴30min ,间或振荡,反复通过22号针头,15000r /min 离心20min ,上清移至另一离心管中。
1.3.2 细胞裂解物的预清除 将S AC 置离心管中,7000r /min 离心15min,将沉淀悬于含0.05%N P -40的细胞裂解液中至原体积,加等体积的无关杂交瘤细胞培养上清,冰浴30min ,用细胞裂解液洗涤3次,再以1/2原体积裂解液悬浮,终浓度为20%。
将等体积S AC 加到裂解上清中,冰浴2h,4℃12000r /min 离心15min ,小心取出上清保存备用。
1.3.3 抗原抗体复合物的形成 将细胞裂解上清(抗原)分为两等份,置于微量离心管中(3×106细胞),各加入N ET-明胶缓冲液(50—678—第23卷 第6期1997年 白 求 恩 医 科 大 学 学 报J .N.BET HU N E U N IV.M ED.SCI. V ol.23 N o.61997m mol/L Tris,p H7.5,150mmo l/L NaCl, 0.05%N P-40,1m mol/L EDTA,0.25%明胶, 0.02%NaN3)至总体积为0.5ml,在一管中加入磷酸化酪氨酸单克隆抗体(Clone2G8.D6杂交瘤细胞培养上清)100μl,在另一管中加入非相关杂交瘤细胞培养上清100μl作为对照, 0℃平缓摇动1h。
1.3.4 靶蛋白的免疫沉淀 加SAC到抗原-抗体复合物中(200μl10%SAC),4℃平缓摇动1h,3000r/min离心6min,弃上清,加入1m l洗涤液(NE T-明胶缓冲液,100mm ol/L Na F,2mmo l/L Na3V O4),振荡悬浮,重复洗涤3次,吸干残液。
加SDS-PAGE上样液30～60μl,振荡悬浮,100℃水浴3min,15000r/min 离心10min,仔细收集上清。
1.3.5 SDS-PAGE〔3〕 10%分离胶, 4.5%浓缩胶,胶厚1mm,胶长12.5cm。
上样蛋白浓度为150～250μg,150V电泳6～8h。
1.3.6 干胶及放射自显影 电泳后,置胶于滤纸上,用保鲜膜覆盖后真空干燥凝胶,压X 光片3～5d。
1.4 W estern印迹 1.4.1 细胞裂解及蛋白质提取 将5×106细胞溶解于0.5m l裂解液(20mm ol/L Tris,p H8.0,137mm ol/L Na Cl,1%N P-40, 10%Glycerol,1mmo l/L PM SF,0.15U Apro tinin/m l,1m mol/L Na3VO4)中,4℃30 min,间或振荡,反复通过22号针头以剪切DN A,15000r/min离心20min,上清加等倍2×SDS-PAGE上样液,沸水浴3min。
1.4.2 SDS-PAGE 8%分离胶,4.5%浓缩胶,胶厚1m m,胶长12.5cm。
上样蛋白为150～250μg,150V电泳6～8h。
1.4.3 转膜 切4张Whatman3号滤纸,1张硝酸纤维膜,用水漂浮浸膜后,浸入水中5min,将膜及滤纸浸入转膜缓冲液(25 m mol/L Tris,192mmol/L Glycine,20% Methanal)5min。
阳极侧依次为滤纸、膜、胶、滤纸,用移液管作滚筒排出气泡。
采用电转印装置60V,4℃转印4～6h或40V,4℃转印过夜。
用丽春红S染液(丽春红S2g,三氯乙酸30g,磺基水杨酸30g,用水定容至100m l,用前1∶10稀释)染膜5～10min,间或轻摇染液。
蛋白带出现后,用水洗膜数次,标记M arker位置。
1.4.4 抗体与靶蛋白结合 硝纤膜置封闭液(3%无脂奶粉,50mmo l/L Tris,p H7.5, 150m mol/L NaCl)中室温孵育2h。
在封闭液中加入磷酸化酪氨酸单克隆抗体(Clone 2G8.D6杂交瘤细胞培养上清)室温2h,以Tris缓冲液(50m mol/L Tris,pH7.5,150 mm ol/L NaCl)洗膜4次,每次10min。
置硝纤膜于新鲜封闭液中,加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠Ig G(Sig ma),室温2h,洗膜4次。
1.4.5 显色 置硝纤膜于显色缓冲液(100mm ol/L Tris,p H9.5,100mmol/L Na Cl, 5mm ol/L Mg Cl2,165m g BCIP/L,330mg NB T/L)中,待区带显示清楚时,用水洗膜终止反应。
2 结果与讨论 采用免疫沉淀技术观察电离辐射对胸腺细胞蛋白质磷酸化影响的结果表明,照射后部分蛋白质明显发生酪氨酸磷酸化,其分子量范围为17000、22000、28000、32000、40000、43000及53000。
Western印迹结果表明,照射后28000及32000蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。
结果揭示在蛋白质酪氨酸磷酸化的研究中,免疫沉淀法优于Western印迹法。
用于检测复杂蛋白质混合物中靶抗原及其含量的方法包括免疫沉淀法、W estern印迹法及固相放射免疫测定法。
免疫沉淀法可应用于复杂蛋白质混合物中靶抗原的定性与定量,整个实验过程是在液相中进行,其独特优点是高选择性、特异性及敏感性,可检出低至100pg的放射性标记蛋白。
该法与SDS-PAGE结合应用是研究原核细胞、真核细胞或体外翻译系统所表达外源抗原蛋白的合成与加工过程的理想技术。
—679—陈沙力等 蛋白质酪氨酸磷酸化-免疫沉淀及W ester n印迹两种方法的比较Western印迹法是对非放射性标记复杂蛋白混合中的某些特定靶蛋白进行定性鉴别及定量分析的方法,实验过程是在固相支持膜上进行,可检出1～5ng中等大小的待检蛋白而又无需像免疫沉淀法那样必须对靶蛋白进行放射性标记。
由于蛋白质的电泳分离几乎总是在变性条件下进行,因此,免疫沉淀法中的溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题能够得到解决。
由于在这一实验中靶蛋白是彻底变性的,故并非所有单克隆抗体都适合用于W estern印迹,而多克隆抗血清是由单一免疫球蛋白组成的不确定混合物,通常对其特异性、亲和力以及浓度都一无所知,因而很难预测用特定多克隆抗血清来测定某一固定化变性靶蛋白上的不同抗原表位的效果。
但Western印迹法在实际应用中遇到的大多数问题都可通过设置适当的对照加以解决。
免疫沉淀法通常是从已被放射性标记的细胞提取物中通过免疫反应沉淀靶蛋白,但还可被用于非标记蛋白的分析,当靶蛋白与抗体解离后,则可使用诸如酶活性检测、放射性配体的结合及W estern印迹分析等方法检出特定的非标记蛋白。
本文所述两种方法结合应用将能修正各自存在的问题。
参 考 文 献1 陈沙力,刘树铮.国外医学放射医学核医学分册, 1996,20:782 陈沙力,孟庆勇,刘树铮.中华放射医学与防护杂志, 1996,16:1613 陈沙力,孟庆勇,刘树铮.白求恩医科大学学报, 1996,22:3164 Kessler S.J Imm unol,1975,115:1617(1996—07—23收稿)Tyrosine phosphorylation of proteins in murine thymocytes-a comparison between immunoprecipitationand Western blottingChen Shali,Liu Shuz heng(MPH Radiobiology Research Unit,NB Univ.of Med ical sciences)Abstract A com pariso n betw een the two m ethods w as perfo rm ed fo r ty ro sine phospho ry la-tion of pro teins in m urine thymo cy tes ex po sed to low dose radia tion using anti-pho spho ty rosine Mc Ab.It was show n tha t tyro sine pho spho rylation o f17.5kD,22kD,28kD,32kD,40kD,43k D and53kD protein mo lecules labelled metabolically with H332PO4appeared in the thymocy tes after radiatio n by immunoprecipita tio n technique and ty rosine pho spho rylation of28kD,32kD pro tein m olecules a ppeared by w estern blo tting.The results sug gest that immunoprecipitatio n is superio r to Western blotting in detectio n of protein ty rosine phospho rylatio n.Key words Thymocy te Pro tein ty ro sine pho spho ryla tion Im muno precipitation W estern blot-ting—680—白求恩医科大学学报 1997年 第23卷 第6期。