聚乙二醇介导的细胞融合
2012年2月19星期一
陈倩倩（118627140313）同作者：郑梦璐谢雨后赵松
1、文摘
细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞的融合,使远缘杂交成为可能,因而是改造细胞遗传物质的有力手段。

它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限,扩大了遗传物质的重组范围。

但融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性,致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等不符合育种要求的性状出现,直接利用杂种细胞作育种材料目前还有许多障碍。

细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作,在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂,投资少,有利于广泛开展研究和推广,有着重大的实践意义,正得到科学界的日益重视。

自从20世纪70年代Kao和Michayluk用聚乙二醇( PEG, polyethyleneglycol) 诱导大麦、大豆等植物原生质体融合后PEG 法诱导细胞融合以其容易制备、活性稳定、不需要特别的仪器设备、操作简便等优点, 被普遍地应用于生物、遗传、医药等研究领域. 高体积分数、高相对分子质量的PEG会对细胞产生毒性,是限制其被广泛应用的瓶颈, 此外,由于该方法涉及的影响因素较多, 进一步加大了获得理想细胞融合率的难度.本实验主要研究PEG的浓度和细胞浓度对细胞融合率的影响。

2、背景介绍
细胞融合现象最初是在动物细胞中发现的。

1958年日本学者阅田善雄用紫外光灭活的仙台病毒在体外诱导艾氏腹水红纲胞相互融合。

1965年他和Harris等在此基础上各自分别采用灭活的仙台病毒,诱导产主了第一个种间融合并培养成活。

一年后Yerganzan又进一步使用仙台病毒获得了能够增殖的杂种细胞。

后来Littlefield 用缺陷型细胞HGPRT-XTK-细胞杂交,用HAT 选择培养基选出杂种细胞,开创了细胞工程的新纪元,继而推动了整个生物工程的发展。

1975年英国科学家Milestein 和Kohler在体细胞杂
交基础上创立了B淋巴细胞杂交瘤技术,他们将在体外不能长期生存的经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）与在体外能迅速增殖的小鼠骨髓溜细胞在聚乙二醇（PEG）或汕台病毒的作用下融合而产生杂交瘤细胞,所得杂交瘤细咆承袭了两种亲代细胞的遗传特性,既保存了瘤细胞在体外迅速增殖传代的能力,又继承了免疫细胞合成和分泌的能力,即能分泌抗绵羊红细胞的抗体。

该技术被誉为免疫学的一次革命其创建者荣获1984年诺贝尔医学和生理学奖。

B细胞杂交瘤可在体外大量培养,也可接种到小鼠腹腔中繁殖。

自1975年以来,世界各国科学家采用B细胞杂交瘤技术已制备出万余种单抗,其中绝大部分为小鼠墓抗。

所谓单抗就是指培养单个杂交瘤细胞使之无性生殖形成细胞集落（称为克隆）,由这些细胞所产生的只能识别和对付一种抗原的特导性抗体就称为单克隆抗体,即单抗。

单抗于八十年代处已领尤商品化，现已有百余种诊断试剂和数种治疗剂投放市场。

目前,单抗新兴产业正在形成。

随着B 淋巴细胞杂交瘤技术的建立和发展,B淋巴细抱杂交瘤技术也发展起来了。

早在1977年就有T细胞杂交瘤的报道,但有功能的、能分泌各种因子的T细胞杂交瘤的报道则始于1978年,如抗原特异的抑制因子,制造T细胞杂交瘤技术的基本操作过程和B细咆杂交瘤技术相似,只是用于融合的细胞是激活或抗原致敏的T 细胞和酶缺陷型的淋巴瘤细胞。

目前,由于技术上的限制,T 细胞杂交瘤还未能发挥其固有的潜能,所以,虽然这项技术开展的时间不短,但收到的成效却不如B细胞杂交瘤那么显著.
最近研究表明,细胞融合与病毒和细胞之间的融合以及细胞内的膜泡融合有许多相似之处, 即带包被的病毒( 或细胞) 通过转膜病毒蛋白介导与宿主细胞的细胞膜进行融合。

I 类病毒融合蛋白包括流感病毒红血球凝集素( HA) 和人类免疫缺陷病毒包被蛋白,它们都具有相似的结构域, 即都具有a- 螺旋结构。

病毒和细胞之间正是通过这些蛋白来完成融合过程( 伴随有构象的变化)的。

细胞内的膜泡融合也是如此, 其相关融合蛋白包括GTPases 及SNARE家族。

因此推测细胞融合采用相似的机理。

然而细胞融合蛋白并不全具有a- 螺旋结构, 提示a- 螺旋并非融合所必需。

3、材料和方法
3.1材料
• 用Alsver液悬浮的鸡血细胞
• Alsver溶液，
• 0.85% 的生理盐水，
• GKN溶液，
• 50% 的聚乙二醇溶液
3.2工具和仪器
• 盖玻片，载玻片，离心管，试管，吸管，显微镜，离心机
3.3实验步骤
1.向1 ml血细胞悬液中加入 4 ml 0.85% 生理盐水，清洗细胞，1000-1200 r/min离心5min。

弃上清。

2. 重复第一步一到两次。

3. 细胞沉淀中加GKN溶液至 2 ml ，混匀。

4. 加0.5ml的混合液到1.5ml的GKN溶液中，充分混匀。

红细胞的密度应该是 1.5×107/ml。

将这一管标记为A。

5. 将0.5ml的液体移到另一个管B中，加1.0ml GKN溶液，充分混匀。

B管中血细胞的浓度变成5.0×106/ml.
6. 按照下表，将A、B中的溶液平均分成三份，分别标记为A1-3 和B1-3 共设立6组每组各含有 0.5 ml 细胞悬液。

PEG
0%17%33%
RBC/ml
5.0×106A-1A-2A-3
1.7×106B-1B-2B-3
7. GKN溶液1, 0.5 and 0ml分别加到第6步中标记的1，2 和3号管中。

然后各管中加0, 0.5 and 1 ml 50% PEG溶液至总体积为2ml。

8. 在室温下静置2-3 min，然后镜检。

9. 将红细胞悬液涂片，在光镜下观察细胞融合情况。

寻找融合细胞并计算融合率。

4、结果
实验记录如下图
分组A-1A-2A-3B-1B-2B-3
004012融合
数
统计
505050505050数
0.000.000.080.000.020.04
融合
率
由上述结果可知：
1.由单独的A组（或B组）内部相互对照可知，在细胞浓度相同的情况下，PEG浓度越大诱导细胞融合率越高。

2，由A－3、B－3组相互对照可知，在相同浓度的PEG的情况下，细胞浓度越大诱导细胞融合率越高。

而矛盾的是，比较A-2、B-2组相互对照结果却正好相反。

5、讨论
1，通过这次实验可以看出，诱导细胞融合成功的因素一方面与诱导剂的浓度有关，在一定的范围内诱导剂PEG的浓度越高，诱导成功率越高；另一方面与细胞的浓度有关，相互接触的细胞才有可能进行融合，因此，在一定的范围内，细胞的浓度越高诱导成功率越高。

2，对于结果2的矛盾可能原因是因为细胞融合本身就是概率事件，而且这次实验仅仅只是一次实验统计的结果，所以结果并不具有代表性。

因此尽管看似矛盾的结果，实际上并不矛盾。

要得到更加明确的结果，需要对更多相同的实验统计得到的结果进行分析。

3，通过这次试验我知道，一次实验的结果并不值得信赖，需要多次统计检验才能获得相对而言比较接近事实的结果。

6、参考文献
1，李秀兰、姜曰水聚乙二醇诱导细胞融合影响因素菏泽学院学报 1673-2103(2007)05-0079-04
2，周显青细胞融合的研究和发展淄博师专学报第二期1995年6月。

3，李保华细胞融合研究进展安徽农业科学,Journal of Anhui Agri . Sci .2008,36(15) :6187- 6188,6207。