作者简介:巨晓英(1985-),女,天津大学农学院在读研究生。
E 2mail:hanye@tju .edu .cn通讯作者:韩烨收稿日期:2008-06-03第24卷第5期2008年9月Vol .24,No .5Sep .2008自然发酵泡菜中乳酸菌的分离鉴定Iso l a ti o n and i den ti fi ca ti o n o f l ac ti c ac i d bac te ri afrom na tu ra l fe r m en ta ti o n p i ckl e s巨晓英JU X iao 2ying韩 烨HAN Ye周志江ZHOU Zhi 2jiang(天津大学农业与生物工程学院,天津 300072)(School of A griculture and B ioengineering,Tianjin U niversity,Tianjin,300072,China )摘要:从多种自制泡菜中分离到了31株乳酸菌,经过形态特征,培养特征和生化特征鉴定,其中16株为戊糖片球菌。
本试验结果表明戊糖片球菌在泡菜的发酵过程中起重要的作用,可能是引起泡菜发酵的优势菌种。
关键词:泡菜;乳酸菌;分离;鉴定Abstract:Total 31strains of lactic acid bacteria were is olated fr om home 2made p ickles .The mor phol ogical,bi ochem ical and gr owth characteristics were deter m ined that 16strains of the m bel ong t o Pedi ococcus pent osa 2ceus .The result indicated that P .pent osaceus p layed i m portant r ole dur 2ing the fer mentati on of p ickles,and they were possibly the dom inant strains of p ickles .Keywords:Pickles;Lactic acid bacteria;Is olati on;I dentificati on泡菜是以白菜、萝卜、黄瓜、甜椒等新鲜蔬菜为原料,添加食盐、水和调味料,利用蔬菜自身附着的微生物或添加人工培养的乳酸菌发酵剂,在厌氧环境下进行乳酸发酵而制成的酸性食品。
泡菜不但味美爽口,而且具有丰富的营养,含有V A 、V B1、V B2、V C 、Ca 、Fe 、胡萝卜素、辣椒素、纤维素和蛋白质等多种丰富的营养成分,在中国很多地区都备受青睐。
泡菜生产主要依靠乳酸菌的发酵作用。
一般自然发酵的泡菜是以异型乳酸菌启动发酵,产生有机酸、过氧化氢和细菌素等物质,抑制其它杂菌的生长,同时产生乙醇、乙醛、甘露醇等风味物质,对泡菜特有风味的形成起决定性作用;之后同型乳酸菌逐渐成为优势菌,进一步降低环境pH 值和抑制有害杂菌[1]。
中国是传统的泡菜生产国,泡菜种类繁多,国内在这方面已经做了大量的工作,分离筛选出了许多生产性能优良的菌种,如植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、干酪乳杆菌、弯曲乳杆菌、短乳杆菌、嗜酸乳杆菌等[2～6]。
但也是由于我国泡菜的多样性,各种泡菜中具体存在何种乳酸菌仍然不清楚。
本试验从多种自制泡菜中分离到了31株乳酸菌,其中有16株为戊糖片球菌,占乳酸菌总数的50%以上,在某种程度上说明了戊糖片球菌是泡菜发酵的重要菌种,为科学腌制泡菜提供了理论依据,也丰富了泡菜工业化生产的菌种来源。
1 材料与方法1.1 材料黄瓜、青椒、胡萝卜、白菜、水、碘盐。
1.2 试剂乳糖、蔗糖、甘露醇、D (+)2木糖、山梨醇等:天津市科密欧化学试剂开发中心分析纯药品;蛋白胨、酵母膏、D (+)2麦芽糖等:北京奥博星生物技术有限公司生化试剂。
1.3 仪器与设备CX21FS1电子显微镜:日本O ly mpus 公司;7230G 可见分光光度计:上海精密科学有限公司;PHS 23B W 精密pH 计:上海理达仪器厂。
1.4 菌种和培养基本试验以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和植物乳杆菌作为试验对照菌。
所用培养基主要有MRS 培养基、TGE 培养基、葡萄糖发酵培养基及碳水化合物发酵管[7]等。
1.5 泡菜制作(1)冲盐卤:先将水煮沸,每100g 水加盐6g 溶化,冷却后备用。
(2)原料预处理:先将黄瓜、青椒、白菜、胡萝卜等蔬菜剔除粗老部分,切成条状或块状后,用清水洗净、晾晒3～5h,保证菜面无水。
(3)泡制:将晾干的菜与调料(辣椒、葱、姜)混合,平均每100g 新鲜蔬菜中,加入葱6g,辣椒3.5g,姜3g 。
将调好的蔬菜装入烧杯中,加盐水并压实,用3层干净的塑料袋装92水封口,至于阴暗处,室温下自然发酵。
除每种原料单独制作一种泡菜外,再将4种蔬菜按质量均匀混合发酵,共制作5种泡菜。
1.6 菌种的分离、纯化无菌条件下从泡菜样品中取发酵汁在MRS平板上划线,37℃恒温培养48h,对其中具有典型乳酸菌菌落特征的菌株进行反复分离、纯化至纯菌落。
将各菌株编号、保存待鉴定。
1.7 菌种的鉴定首先对得到的纯菌种做革兰氏染色、过氧化氢酶和葡萄糖发酵试验,革兰氏染色阳性、无芽孢、过氧化氢酶阴性、发酵葡萄糖产酸的初步认定为乳酸菌,然后进行其他生理生化试验鉴定其为何种乳酸菌,具体试验包括耐pH值试验、耐盐试验、耐热试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、石蕊牛乳试验、运动性试验及碳水化合物发酵等试验[7]。
2 结果通过MRS平板划线法分离纯化及乳酸菌的初步筛选,共自制泡菜中分离得到了31株乳酸菌,从该31株乳酸菌进行的耐受性试验结果中发现其中16株对pH值、盐浓度和温度的耐受性(10%NaCl除外)一致,进而集中对该16株菌株进行鉴定。
2.1 菌株的形态特征及培养特征形态特征(图1):球状或球杆状,无芽孢,成对或4叠排列。
培养特征(图2):菌落呈乳白色,圆形有凸起,表面光滑,边缘整齐,不透明或半透明,液体培养后菌液浑浊,无菌膜。
2.2 菌株耐受性特征16株菌株均在pH4.4,7.0,6.5%NaCl条件下生长, pH9.6和18%NaCl和50℃条件下不生长。
图1 戊糖片球菌菌落形态Figure1 The col onial mor phol ogy ofpedi ococcus pent osaceus图2 戊糖片球菌个体形态Figure2 The individual mor phol ogy ofpedi ococcus pent osaceus2.3 菌株生理生化特征16株菌株的生理生化特征见表1。
表1 菌株生理生化特征及糖发酵试验Table1 Physi ol ogical2bi oche m ical characteristics and utilizati on of carbon s ources of the16LAB strains 菌株运动性10%NaCl明胶液化石蕊牛乳淀粉水解蔗糖麦芽糖木糖甘露醇山梨醇A1(1)-----+++--A2(1)-----+++--A2(2)-----+++--B2(2)-----+++--C2(1)-+---+++--C3(1)-----+++--C4(2)-----w++--C5(1)-----+++--C6(2)---+-+++--D1(1)-----w++--D4(1)---+-+++--D4(2)-----+++--D5(1)-----+++--E4(1)-----+++--E4(2)-+---w++--E6(3)-----+++-- +表示阳性,-表示阴性,w表示弱阳性。
03科研开发 2008年第5期 根据菌株的形态特征、培养特征和生理生化试验结果,依据《伯杰细菌鉴定手册》[8]和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[9],将该16株片球菌归类为戊糖片球菌。
由于试验条件及时间的限制,本试验未对其它性质较分散的菌株作进一步的鉴定。
3 结论(1)本试验从多种自制泡菜中分离到的31株乳酸菌中有16株为戊糖片球菌,且其余15株性质分散,根据其耐受特征就可分为5类,这在一定程度上说明了片球菌在泡菜发酵过程中发挥着重要的作用,很可能是引起泡菜发酵的优势菌种,可以作为纯菌种发酵泡菜。
该结果丰富了我国泡菜中优势乳酸菌的种类,为泡菜工业化生产提供了更多的菌种选择。
(2)国外文献在泡菜中优势乳酸菌的问题上,大都提到了片球菌。
而国内关于自然发酵泡菜中乳酸菌的文献,大多集中于明串珠菌和乳杆菌,很少有关于片球菌的报道。
其中可能有如下两方面的原因:一是自然发酵泡菜是依靠其自身携带的菌种发酵而成的,蔬菜表面的菌种受到地域、季节、蔬菜品种、栽培方式等因素的影响,导致不同产品的菌种有所不同;二是国内许多关于泡菜中乳酸菌的研究,集中于优势菌种,而所谓的"优势"是以产酸速度及耐酸性来衡量的,在优势乳酸菌的筛选过程中,可能片球菌被淘汰了,根据Nan2 cyJ.Gardner等[10]的试验结果,片球菌在产酸能力上确实稍差于乳杆菌和明串珠菌。
(3)一些菌株还可产生细菌素抑制某些病原菌[11,12],并且相关研究证明戊糖片球菌应用于食品生产不存在安全隐患[13～17]。
所以从食品安全的角度讲,研究戊糖片球菌产细菌素的能力及其抑菌谱对将来食品工业的发展具有深远的意义。
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