考核操作题（一）
自行在NCBI核酸数据库内检索一个基因CDS序列(长度
大于500bp)，完成下列操作（10分）。
① 将查找到的CDS序列以“基因登陆号.txt”文件保
存
② 设计一对引物扩增此基因片段，要求在搜索标准
窗口设置PCR扩增产物长度为200～500bp。
③ 新建一个word文档，报告引物搜索结果的第1#引
/nuccore/19881396?from=455&to=3 511
/nuccore/19881396?report=fasta&from=455&to= 3511
将查找到的CDS序列以.txt文件保存
Load sequence
Primer Premier 启动界面
导入已知的BPMV CP基因的CDS(coding sequence)序列 note：存储的文件 路径及名称不能含 有中文。
Press OK
序列导入结果显示窗口
在目的序列的第一个 碱基处双击
Genbank窗口
点击“primer”按钮
4、引物的碱基分布
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷
酸的成串排列。
引物3＇端的碱基分布
引物3＇端最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对
引物3＇端最好以C或G结尾，避免使用A 引物3＇端避免出现3 个以上连续的C或G,如GGG 或CCC 引物3＇端5个碱基G+C不宜超过3个
产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度,使PCR反应不能正常 进行。
hairpin
引物自身形成二聚体（self-dimer）
Forward primer: 5 AACCTCTCGCTGCAGTTCTTCC 3 3 CCTTCTTGACGTCGCTCTCCAA 5 Forward primer: 5 AACCTCTCGCTGCAGTTCTTCC 3 3 CCTTCTTGACGTCGCTCTCCAA 5
构时要加上它们。
三、引物设计软件
常用引物设计软件：
Primer Premier 5.0 Primer 3
DNAman
Oligo 6（引物评估软件）
（一）序列查找和下载
/
/nuccore/NC_003495.1
5、引物的ΔG值
∆G 值是指DNA双链形成所需的自由能，反映了双链结构内部碱基
对的相对稳定性。 3 ‘端∆G 值应较低，否则易引起错配。
6、引物的互补情况
引物自身及引物之间不宜存在互补序列。如果引物自身折叠成发
夹结构（Hairpin），会因空间位阻而影响引物与模板的结合。
引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5Kcal/mol）,易导致
一、引物设计流程
序列查找和下载 序列同源性比较
引物设计与筛选
引物加工与修饰
引物的评价分析 引物的二次筛选
引物的最终评估
二、引物设计原则
（一）基本原则
引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体(dimer)
或发夹结构(hairpin)
引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反
引物设计是PCR技术中至关重要的一环，其优劣直接关系到
PCR的特异性和实验能否成功。
PCR的基本原理
三步循环：变性、退
DNA模板
95℃（解链）
火、延伸������
1.变性：双链DNA解
链成为单链DNA ������
2.退火：部分引物与
DNA单链
60℃（退火）与引物结合 Reverse primer Forward primer 72℃（延伸） Taq酶，dNTPs,
物及扩增基因长度，附上引物设计窗口和引物数 据库窗口图。
3.1 引物设计
（primer design）
引物的定义
引物（primer）是一段短的单链DNA或RNA片段，可结合在
DNA模板链上与之互补的区域，作为DNA复制的起始点。
体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应(Polymerase
Chain Reaction，PCR )、测序和探针合成等。
GTGATGTTCCTGACGGTACTC TAAAGTCACCGTGGACGGACC
5
Forward primer/sense primer: 5 CACTACAAGGACTGCCATGAG Reverse primer/anti-sense primer : 5 CCAGGCAGGTGCCACTGAAAT
应(即错配)
（二）一般原则 1、引物的长度 一般15～30bp，常用18～24 bp。
引物过短容易引起错配现象，引物过长会导致PCR延伸温度大于
74℃，不适于Taq DNA聚合酶。
2、引物扩增跨度
即产物长度，以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长
至10kb的片段。
3、引物的特异性
在模板cDNA的保守区内设计引物。 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物（1）
MⅡ
61
63
65
NC
1200bp 900bp 700bp 500bp 300bp 100bp
DNA模板链、编码链与转录及翻译的关系 5′···GCAGTACATGTC ···3′ 3′··· c g t c a t g t a c a g ···5′
反转录 转录 编码链(CDS) 模板链
将查找到的CDS序列以.seq文件保存
将查找到的CDS序列以.seq文件保存
（二）序列同源性比较
1、利用在线的NCBI中的BLAST工具进行比较 2、利用DNAman等软件进行多序列比较
序列比对
参数一般默认
序列比对结果
（三）引物设计与筛选
1、利用Primer Premier 5.0 软件设计引物，扩增BPMV CP 基因片段。
5′···GCAGUACAUGUC ···3′
翻译
mRNA
N· · · · · · Ala · Val · His · Val · · · · · · C
蛋白质
PCR 模板:cDNA
CDS（coding sequence）是编码一段蛋白产物的DNA序 列。一般以ATG开始，以TAA、TAG、TGA结尾。 cDNA （complementary DNA）是与RNA链碱基互补的 单链DNA，或此DNA链与其碱基互补的DNA链所形 成的DNA双链。
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
退火温度=Tm值-5℃
9、引物的修饰情况
引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
引物5′ 端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光
、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插 入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
在计算Tm值时不必考虑附加序列，但在检测互补及二级结
点击“search”按钮
引物搜索选项设定
Press “OK”
搜索结果
Press “OK”
搜索结果窗口
点击选中一对引物
引物设计窗口
挪开“Search Results”窗口
引物数据的保存
引物数据库窗口
3.引物已输入到
数据库中
2.点击“Export”
1.按“Ctrl”，选择引物
引物合成订单
选择引物，点击菜单栏“Function”→ “order form” → “new form” ,弹出 “Synthesis order form”窗口
上下游引物之间二聚体（cross dimer）
Reverse primer : 5 CTGTGCTCTCTCATCATCATATTC Forward primer: 3 CCTTCTTGACGTCGCTCTCCAA
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物（2）
Gill 59 61 Kindey 59 61 63
MⅡ 57
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
63
65
57
65
NC
Target segment: 813 bp
900bp 700bp
←dimer
7、引物的GC含量
G+C含量以40-60%为宜。 G+C太少，PCR扩增效
果不佳；G+C过多，易出现非特异条带。
8、引物的Tm
合理的退火温度为55～70℃
两引物的Tm 值相差不应大于5℃
模板的单链DNA的 特定互补部位相配对 和结合
3.延伸：以目的基因
Mg2+
为模板，合成互补的 新DNA链
PCR Rrimers
5
CACTACAAGGACTGCCATGAG ATTTCAGTGGCACCTGCCTGG TAAAGTCACCGTGGACGGACC 5
3
5 CACTACAAGGACTGCCATGAG 3