2.竞争法
•抗体的检测一般不采用竞争法。 •抗体的竞争法测定不同于单个抗原决定簇的小分 子抗原的竞争法。 •测定可靠性受竞争抗体的特异性和亲和力影响。 亲和力的差异易造成部分无法解释的结果。
待测Ab
HBeAb竞争法（改良）
固相Ag
酶标Ab E
HBeAb竞争法（传统）
显色强弱与 待测含量呈反比
待测Ab
非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定(ELISA)
1、均相酶免疫分析技术
均相酶免疫分析又叫勿需分离的酶 免疫分析，酶标抗原与抗体结合后，其 中的酶活性将被减弱或增强，因此不需 分离即可测定反应系统中酶活性的变化， 从而推算出待测物的含量。
酶增强免疫测定技术示意图（EMIT）
标本抗原
EMIT的基本原理及特点： 半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。 当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触， 使酶的活性中心受到影响而活性被抑制（图A）。 从酶活性的测定结果就可推算出标本中半抗原的量。 标本抗原浓度与显色程度成正比。
中和Ag
E 酶标Ab
固相Ab
中和Ag
E 酶标Ab
4. 捕获法测IgM抗体
• 血清中某些抗原的特异性IgM常和特异性 IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定
• 捕获法：先将所有血清IgM（包括特异性 IgM和非特异性IgM）固定在固相上，再测 定特异性IgM。
捕获法测IgM抗体示意图
RF的干扰
检测抗原的方法
1. 双抗体夹心法
顾名思义，由两个抗体夹一个抗 原形成“三明治”复合物，来检测抗 原的方法，仅适合于至少含两个抗原 决定簇的多价抗原检测。
固相 抗体
固相载体
待测抗原
E 酶标
抗体
1. 抗体（检测抗原） 2.加样本、孵育、洗涤 3.加酶结合物、孵育、洗涤 4.加底物液、终止液、比色
EE EE
双位点一步法测抗原示意图
钩状效应（hook effect） 当标本中待测抗原浓度相当高时，过量 抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不 再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含 量，严重时甚至可出现假阴性结果。（类似 于沉淀反应中抗原过剩的后带现象）
应用
如：乙型肝炎表面抗原的检测（HBsAg）
3. 竞争法
试剂制备 反应条件的选择 操作的标准化
1. 试剂制备
（1）抗原和抗体的选择 （2）固相载体选择 （3）酶的选择及标记过程 （4）底物 （5）终止液
★ （1）抗原和抗体
酶标记抗体或抗原也称为结合物(conjugate) 要求： • 抗原纯度高、抗原性完整 • 抗体特异性好,效价高,亲和力强,比活性高 • 用于ELISA的抗体有多克隆和单克隆，效果
第五课（第一部分） 酶免疫技术
酶免疫技术特点 ELISA 的原理和类型 ELISA 的技术要点
一、酶免疫技术的定义和特点
以酶标记抗体或抗原作为主要试剂，利 用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特 异性抗原-抗体免疫学反应检测的敏感性的 一种标记分析技术，称为酶免疫技术 （enzyme immunoassay，EIA）
BAS-ELISA法示意图
待检标本
应用
由于BAS-ELISA法的放大作用， 可对体内含量极微的物质进行检测， 例如：细胞因子、粘附分子等的检测。
不同试剂生产厂家，测定同一种物质而设计 ELISA方法可有所不同，但都是在以上几种经典方法 的衍化和变通。
三、ELISA 的技术要点
ELISA技术要点包括三个方面：
检测抗原
阴性
阳性
底物液、终止液
Colorless OD
浓度
应用：
如：乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、细胞 因子、肿瘤标志物AFP、CEA等的测定
2. 双位点一步法
在双抗体夹心法的基础上发展而 来，所检测抗原有两个不同的抗原决 定簇，两种针对不同抗原决定簇的单 克隆抗体可同时和抗原反应，生成夹 心式“三明治”复合物。
（一）ELISA的基本原理以检测抗原为：固相抗体待测抗原
E 酶标抗体
固相载体 ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay(酶联免疫吸附试验)
（二） 方法类型
检测抗原的方法
1. 双抗体夹心法 2. 双位点一步法 3. 竞争法
检测抗体的方法
1. 间接法
2. 双抗原夹心法 3. 竞争法
应用：
• 主要用于检测小分子激素和半抗原 （如：药物）
2、异相酶免疫分析技术
异相酶免疫分析要求，酶标抗原与 抗体结合后，需采用适当的方法分离游 离的和抗原（或抗体）结合复合物-酶标 记物，测定底物显色程度，从而推算出 待测物的含量。
异相液相酶免疫分析 固相酶免疫分析——ELISA
3、ELISA 的原理和类型
2. Sample (human antibody ) 1. Antigen coating
E EE
附：
国际通用的标准板形是8X12的96孔式
附： 酶标仪图
吸光度与抗体浓度标准曲线
OD值
[antibody]
优点
只要更换不同的固相抗原， 用一种酶标抗抗体就可检测出各 种相应的抗体。
应用
人体内多种自身抗体检测，如： 抗CCP抗体、抗心磷脂抗体等
测定抗原：受检抗原和酶标抗原竞 争与固相抗体结合，因此结合于固 相的酶标抗原量与受检抗原的量呈 反比。
AgE+Ab AgEAb + Ag
AgAb
竞争法示意图
检测抗体的方法
1. 间接法测抗体
所谓间接法是指利用酶标记 的抗抗体（即二抗）来检测与 固相抗原结合的抗体。
间接法检测抗体示意图
5.Stop solution 4. Substrate 3. Anti-(human) Ig-enzyme
酶免疫技术一般由两部分组成：
1. 抗原+抗体 IC（酶标抗原或抗体参与）
2. 底物
抗体或抗原上的酶 显色
色泽程度与IC中的酶活性及数量相关，
颜色深浅可确定待测抗原或抗体存在或含量
特点: 免疫反应的高特异性 酶(专一性)催化反应的高效性及高灵敏度
二、酶免疫技术的分类
酶免疫组化技术 酶免疫测定技术
均相酶免疫测定 液相酶免疫测定
捕获法测 IgM抗体 实际上夹 心法的两 次运用
应用：如：检测乙肝IgM型抗体
6. BAS-ELISA（参见相关章节）
生物素亲合素-ELISA
亲合素：Avidin 生物素：Biotin
System
• 1个亲合素可以和4个生物素分子亲密结合，虽 不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，一经结 合就极为稳定。 • 把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大 大提高ELISA的敏感度。