b）细菌抗性原理 Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，阻止四环 素通过细胞膜进入细菌细胞内。
（2）抗菌素选择原理
不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基 （选择培养基）中生长。
当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生 长。
抗性基因
死
抗菌素
活
4. 人工构建的质粒载体的类型
呈超螺旋（SC）（super coil）
② 开环DNA（ open circular， ocDNA）
一条链上有一至数个缺口。
③ 线形DNA （ linear ，lDNA）
（5）质粒空间构型与电泳速率
同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： 超螺旋（sc)最快、线形（l ）次之、开环（oc）最慢。
原核表达载体的重要调控元件
1．启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成 的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动 子，基因就不能转录。 由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核 表达载体所用的启动子必须是原核启动子。 原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动 子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、 T7噬菌体启动子等。
2. 质粒载体必须具备的基本条件
（1） 具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因 （3）若干限制性内切酶的单一位点： 用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。 （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。 是筛选的标志。
3. 质粒的选择标记及其工作原理：
（1）选择标记 ① 抗菌素抗性 绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记： 氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr）
通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽 键的形成。杀死生长的细菌。
b）细菌抗性原理 Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。
iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）
a）杀菌原理
通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。杀死细菌。
b）细菌抗性原理 Kanr 编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻 断其与核糖体结合作用。
iv）链霉素（Streptomycin，Str）
a）杀菌原理 通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。杀死细菌。
b）细菌抗性原理 Strr 编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其 与核糖体30S亚基结合作用。
v）四环素（Tetracycline，Tet）
a）抑菌原理 通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽 键的形成。杀死生长的细菌。
（1）高拷贝数的质粒载体
ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点，达到每个细胞 的拷贝数1000—3000个！ 适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。
（2）低拷贝数的质粒载体
由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。 pLG338、pLG339、pHSG415等 不适合大量扩增DNA用。 但有特殊用途: 当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的 正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。
常用抗菌素的抗性工作原理
i）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp） 青霉素的衍生物。 a）抑菌原理 通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。 b）细菌抗性原理
Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的-内酰胺 环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理
脱离
整合
F因子的四种细胞形式：
a）F-菌株， 不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接 收 F因子而变成雄性菌株（F+）；
b）F+菌株， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。 c）Hfr菌株，F因子整合到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。 d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。 细胞表面同样有性菌毛。
F+×F-杂交
b、抗性因子（Resistance factor，R因子）
带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗 性性状（resistance）。
c、产细菌素的质粒
细菌素一般根据产生菌的种类进行命名： 大肠杆菌（E. coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素）， 而质粒被称为Col质粒。 一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死同种但不 携带该质粒的菌株。
3. 载体的种类
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid）
是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。
存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
（3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构 建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比 Lac和trp都强。 Tac启动子受IPTG的诱导。
（4）T7噬菌体启动子：它是来自T7噬菌体的启动子，具有高 度的特异性，只有T7RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克 隆化基因独自得到表达。T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌 RNA聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许 多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些 不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。这个系统可以 高效表达其他系统不能有效表达的基因。
f、隐秘质粒（cryptic plasmid）
隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方 法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。 它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。
在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体 （一般加上抗性基因）
三、大肠杆菌中质粒的类型
在大肠杆菌中的质粒，可以分为： 接合型质粒 能自我转移
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。 如pDF41、pDF42、pBR329。 外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体
直接选择转化后的细胞。
Direct selection vectors
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。 目前通用的runaway plasmid vectors
这是一类温度敏感型复制控制质粒。 1979年B. E. Uhlin等构建。 如pBEU1、pBEU2。 温度低（低于37 oC），拷贝数很少； 温度增加（>40 oC）时，拷贝数会很快增加到 1000个以上。
（4） 插入失活型质粒载体
（1）分子量大，拷贝数低
第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长 9.1 kb。 有一个EcoR I切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。
（2）筛选标志不理想
ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。 colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌 斑”。 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。
四、质粒的复制类型
1. 严紧型质粒（stringent plasmid）
拷贝数少，只有1—3份拷贝。
（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。 2. 松弛型质粒（relaxed plasmid） 拷贝数多，有10—60份拷贝。
（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。
五、质粒载体的构建
1. 天然质粒的局限性
（1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子 上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基 因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构 所组成。乳糖及某些类似物如IPTG可诱导转录发生。
（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏 蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动 子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯 酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的 活性，促使trp启动子转录。
a、致育因子(Fertility factor，F因子)
又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌 的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。 F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于 细胞中，所以又称之为附加体(episome)。 携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株 称为F-菌株（相当于雌性）。
OC L SC
二、质粒的主要种类
致育因子（Fertility factor，F因子） 抗性因子（Resistance factor，R因子） 产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid） 毒性质粒（Virulence plasmid） 代谢质粒（Metabolic plasmid） 隐秘质粒（Cryptic plasmid）
大肠杆菌的质粒
1. 质粒的一般生物学特性
（1）分子小： 1—200 kb （2）编码基因少： 2—3个中等大小的蛋白质。 如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必 须）。
（3）环形状：
双链环状DNA。
（酵母的“杀伤质粒”是RNA）。
（4）质粒的空间构型：
① 共价闭合环状DNA（cccDNA) Covalent close circular DNA
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。 注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。 如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于 大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下。