实验二分光光度技术测蛋白、多糖含量
姓名：侯红芬学号：161202085 专业：细胞生物学
一、实验目的
1、掌握分光光度技术的工作原理；
2、熟悉分光光度计的操作。

3、掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和方法以及硫酸-苯酚法测定多糖含量的原理。

二、实验原理
分光光度技术是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术，分光光度计波长范围包括400-760nm的可见光区和波长范围为200-400nm的紫外光区。

而蛋白质含量有多种测定方法，考马斯亮蓝染色法就是其中一种。

考马斯亮蓝G250是一种染料，在游离状态下呈棕红色，当与蛋白质结合后成青蓝色，考马斯亮蓝G250与蛋白质结合，在0-1000μg/ml范围内，在波长595nm下的吸光度与蛋白质含量呈正比，与标准曲线对比计算后，就可得出蛋白质的含量。

多糖在硫酸作用下脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合生成一种橙红色化合物。

在10-100mg范围内其颜色与糖的含量成正比。

在490nm波长下有最大吸收峰，故用比色法在此波长下测定。

三、实验仪器和试剂
分光光度计，移液枪，试管及试管架，考马斯亮蓝，标准蛋白样品，未知样品，蒸馏水，硫酸，多糖样品。

四、实验步骤
1、蛋白质含量的测定
（1）标准蛋白溶液：称取100mg标准蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成1mg/ml的溶液。

（2）考马斯亮蓝染液：考马斯亮蓝G250100mg溶于50ml 95％乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml。

（3）标准曲线的制作。

取7支试管并做好记号，第一支试管加入5ml考马斯亮蓝染液和1ml的水，1号试管加入100μl的标准蛋白液和900μl的水，（10%浓度）然后2、3、4、5、6、7号试管依次加入20%、40%、60%、80%、100%浓度的蛋白液。

（4）样品蛋白溶液吸光度值的测定以及含量的计算。

2、多糖含量的测定
（1）配置80%苯酚：80g苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20g水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

使用时配制6%苯酚：取75μl的80%苯酚于烧杯中，加入960μl水。

（2）制作标准曲线:准确称量50mg标准样品于500ml容量瓶中配成0.1mg/ml的标准溶液，用蒸馏水分别配成0、0.02、0.04、
0.06、0.08、0.1 mg/ml。

1 ml标准液分别加入 6% 苯酚溶液1 ml，
并迅速加入浓硫酸5 ml，静置10 min。

摇匀，30℃放置30 min 后于490nm测定OD值，以葡萄糖含量为横坐标，OD值为纵坐标，制作得到标准曲线。

（3）样品含量测定：吸取1.0ml样品液，按照上述步骤操作测
定OD490，并代入标准曲线计算样品的总糖含量。

五、注意事项
（1）标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。

（2）所作标准曲线仅供短期使用。

（3）比色皿2光面与2毛面，光学表面对准光路，不能有任何污损，否则会引起光吸收的增加。

（4）本次试验，考马斯亮蓝可使玻璃比色皿着色，酒精浸泡后清洗。

六、实验结果
表一不同浓度下标准蛋白的吸光度值
表二不同浓度下未知蛋白的吸光度值
根据以上两个表格中的数据得出，未知蛋白的含量为74.1%。

七、讨论
所做标准曲线不是太好，但在标准曲线附近有几个点还算勉强可以，未知蛋白所做的曲线不错。