光合细菌中番茄红素的研究摘要:番茄红素是一种具有多种生理功能的类胡萝卜素,通常从番茄的果实中提取,价格昂贵一些光合细菌也可以产番茄红素,从而使得利用微生物发酵法生产低成本番茄红素成为可能.本文通过正交实验等方法研究了1株紫色非硫细菌7一1的生长及产番茄红素的最佳培养条件.在以0.4%的乳酸钠为碳源,0.05%的谷氛跳胺为氮源,M才+10pPm,并添加0.1%的酵母粉作为生长因子的改良RcvBN培养基中,7一1菌发酵液在72h内菌浓度可达5.08xl01“个/礼,紫外吸收光语表明细胞内番茄红素的含量明显提高,高效液相色谱法测定出细胞内番茄红素的含量为398.7nl创1009菌体干重.关键词:番茄红素;光合细菌;培养条件;高效液相色谱番茄红素(LycoPene)的分子式为c,飞,分子量536.88,其结构如图1所示,是由11个共扼双键和2个非共扼碳一碳组成的直链型碳氢化合物[‘〕,是1种非常重要的类胡萝卜素,是许多类胡萝卜素生物合成的中间体.因其末端未成件芷香酮环,所以不能分解成维生素A,不是维生素A源,所以其作用一直未引起人们重视川.但在最近几年的研究发现,番茄红素有比其他类胡萝卜素更优越的功能,如其抗氧化性能在类胡萝卜素中最强,清除单线态氧的能力是目前常用抗氧化剂维生素E的100倍、俘一胡萝卜素的2倍多图,是少数与减少疾病危害有关的类胡萝卜素中最主要收稿日期:2(X又‘01一肠基金项目:山东大学微生物技术重点实验室开放基金资助作者简介:钱卫(l灾刃一),男,学士,工程师,主要从事生物工程的研究和应用.,通讯作者112山东大学学报(理学版)第39卷1实验材料与方法图1番茄红素结构图Fig.1StnlctoofLycopene的一种.另外,番茄红素在诱导细胞一细胞通讯和肿瘤细胞增殖的调控方面发挥了一定的作用闭.番茄红素的防癌作用已经被公认,特别是对于预防前列腺癌、胃癌、皮肤癌、宫颈癌等,有明显效果〔,一’].近来,有许多流行病学家也报道了番茄红素在预防心血管疾病方面的作用[s].离体细胞培养实验表明,番茄红素可以调节胆固醇的代谢,将人的巨噬细胞系与番茄红素一起培养,发现番茄红素可以抑制胆固醇的合成,增大巨噬细胞低密度脂蛋白(LDL)受体,从而有效防止心血管疾病.总的来说,番茄红素的生理功能包括:(1)抗氧化作用,其在类胡萝卜素中抗氧化作用最强;(2)具有抗癌、防癌作用,体内番茄红素含量低与某些癌症和肝硬化的发生有相关性;(3)具有活化免疫细胞的功能;(4)可防止心血管疾病的发生;(5)能够清除香烟和汽车废气中的有毒物质川;另外,番茄红素还与人的寿命有关.所以,番茄红素是目前国际上功能性食品成分研究中的一个热点.番茄红素广泛存在于番茄、灯笼大红辣椒、蔷薇果、西瓜、柿子、南瓜的果肉、葡萄袖的果实以及红色细菌等中.其中含量最高的是番茄的果实,每1009果实含番茄红素3一14mg,番茄皮中含有较多的番茄红素(一般每1009左右含20mg)[0〕,我国新疆番茄酱每1009中番茄红素可达40mg以上[s].所以,目前番茄红素主要是从番茄中提取,需要大量的番茄来保证工业生产的连续性和低成本,而且番茄不便运输,其生产受气候条件影响也较大.若能利用光合细菌来生产番茄红素,既可以克服气候和产地限制,又可采取改变培养基、提高菌浓度、筛选高产菌株等方法降低成本.因此,利用光合细菌生产番茄红素是一种非常有前途的生产方式.目前分析番茄红素的方法有柱层析法、纸层析法、薄层层析法、紫外分光光度法、溶剂法和微波法、TLC法、超临界流体色谱分析法、高效液相色谱(HpLC)法等[‘”一‘2〕.本文采取的是紫外分光光度法和高效液相色谱法.以往未见有对光合细菌产番茄红素及其高效液相分析的报道,本文即从这方面着手研究,为将来应用于工业生产打下基础.1.1菌种来源兼性厌氧光合细菌猫。
面6配化r阴haero瀚7一1, 由本实验室分离保存.1.2试剂与仪器1.2.1试剂番茄红素标准品为Siglla公司产品.乙睛,二氯甲烷,甲醇为色谱纯试剂,其他为国产分析纯试剂.1.2.2仪器、设备高效液相色谱仪(Shin班dZu忧一10AvP),uv240紫外分光光度计,超声波细胞破碎仪(S川105vC- 500),HeraeuS离心机.1.3培养基RevBN培养基[‘,〕:RevBN改良培养基(即9号培养基)1.4菌体培养1·4.1菌种活化将冰箱(一20℃)保存的菌种在RCvBN半固体培养基中穿刺接种,于so℃2(XX)h光照温箱中培养48h,再转接至RcvBN液体培养基,在30℃温箱中培养48h(巧oo一2(XX)h),即为液体种子.穿刺培养物作为菌种封口保存于冰箱中.1·4.2菌液培养按10%接种量将活化后的液体种子接种于新鲜的BCVBN液体培养基中,静置于30℃温箱中(1500~2仪X)h光照强度),微好氧培养48h,为正交实验备用.发酵实验中,培养方法相同,按10%接种量逐级放大.1.5正交实验将RcvBN液体培养基中的碳源、氮源、生长因子和硫酸镁去掉,换成各试验所需的各因素及水平.培养基主要成分的优化组1见表1、表2,组2见表3、表4.1.6色素分析1.6.1光合色素光吸收图谱测定发酵液13仪幻r/而n离心收集菌体,菌体用蒸馏水洗涤两次,得到的深红色菌体重悬于丙酮中,用超声波细胞破碎仪破碎(2田瓦,破碎55,间隔55,工作20次),然后13(X刃r/面n离心巧而n,弃沉淀,得红色透明的色素溶液,以丙酮为对照,用UV24()紫第3期钱卫,等:光合细菌中番茄红素的研究113外分光光度计进行350一以刃nm波长范围的光吸收扫描,得该菌丙酮提取液的吸收光谱图.表l正交表(肠(罗))Tal〕.1lbbleof4facto玲即d31evels试验号表2培养基成分各因素及水平1’a]〕.2Fac10玲出ldlevelsofnM,五山11似四),检测波长454nln,洗脱剂:v叭姚:v叭oH:V叭cN:V、。
=32:38:29:1,流速为0.5心而n,温度为室温.1.6.2.2标准曲线的绘制精确称取smg番茄红素标准品,用二氯甲烷溶解后,定容至25mL,使其质量浓度为0.2nlg/mL,然后用二氯甲烷依次稀释成系列质量浓度:0.1、0.05、0.025、0.0125、0.仪万25呵mL,分别进样20拼L,以峰面积为纵坐标,质量浓度(mg/mL)为横坐标绘制标1.6.2.4样品高效液相色谱分析20mL发酵液经离心洗涤破壁后用丙酮定容至50mIJ,样品经0.2脚孔径的虑膜过滤,进样20拌L,根据其峰面积和标准曲线计算番茄红素的含量.__水平因子—1231.碳源(0.2%)乙酸钠甘油乳酸钠2.氮源(0.m%)谷氨酸丙氨酸谷氨酞胺3.生长因子(0众刀1%)对氨基苯甲酸酵母粉硫胺素4.硫酸镁(即m)25102实验结果与分析2.1正交实验结果光照30℃,咒h培养,实验结果见表5表5培养基成分正交实验结果Tal刃.5Resultsofm曲ulnelen祀ntst韶ts表3正交表(肠(33))1’al〕.31’ab】eof3facto玲明d31evels试验号结果第1组(菌浓度1护个/礼)第2组试验号12393表4培养基成分各因素及水平lb】〕.4Facto招田ldIevehofmeditirn__水平囚寸—1231.碳源(0.4%)2.氮源(0.05%)3.硫酸镁(pplll)乙酸钠谷氨酸钠苹果酸乳酸钠硫酸铰谷氨酞胺5101.6.26.2利用高效液相色谱仪分析色谱分析条件色谱柱是岛津Vp~onsels柱(15omrnx4.6mm,13.印4.70320.612.6412.315.953.025.1260.8551.9270.9201.9884.1410.197.88508根据正交实验结果可以看出,第1组的3号培养基和第2组的9号培养基菌量最大,从表中还可以看出,酵母粉对于菌体的生长和色素的产生,效果都极其明显.为了与RCVBN液体中的碳源和氮源的情况作一比较,又设计了第2组正交.结果显示,乳酸钠,谷氨酞胺的组合最好,与3号相符.因此,选择第1组的3号培养基和第2组的9号培养基以RCVBN培养基为对照进行同步培养,30℃,2(XX)h强度光照培养72h,离心、洗涤、破壁、丙酮提取,在350一以洲)Iun波长下扫描,结果见图2:114山东大学学报(理学版)第39卷上上上上一一一……}}}}}}}}}}}}}介‘‘一一一一一一一一一一一一一一_.一_二—」」图2分别生长在不同培养基中的7一1菌丙酮提取液的吸收光谱图(a)RcvBN培养基,(b)3号培养基,c)9号培养基.Fig.2川珊甲石on51祀cln”1拐of刊1仪】01坦Ctersphaeroides(7一1伽n)growingindifferentIne山~(a)RCVBNm汕um.(b)N气n证℃n3rnediurn.(C)N山ld犯n9nlallum.从吸收光谱图中可以看出改良后的培养基,456一487nm处的吸收峰区明显增高,成为主要的吸收峰区,根据有关报道知番茄红素的吸收峰就在这个区域内,即通过改良培养基,发酵液中番茄红素的含量也有所增加,达到了优化培养基的目的.9号培养基中的吸收峰更高,因此下面实验选用9号培养基作为产番茄红素的培养基,培养7一1菌株,对其产色素情况进行进一步的研究.2.2高效液相色谱分析结果番茄红素高效液相色谱的分析结果见图3.(a)(b)(e)图3番茄红素样品的高效液相色谱图(a)标准品的色谱图;(b)9号培养基样品的色谱图;(c)番茄红素标准品+9号培养基样品的色谱图.Fig.3HI吸尤ofLyeo]犯nesamples(a)Clln姐扭t卿扭11ofLye卿ne51田lda司;(b)Cllron坦tog冠mofsaznpleg;(c)CIUnnlat卿翅llof场copenestalld叭l+Clin)nlatogranlofSalnple9.图3(a)结果显示的是番茄红素标准品,其保留时间为6.254而n,根据本文描述的标准曲线绘制方法测定出番茄红素质量范围0.1一1.0鸿时,番茄红素的回归方程是Y=498752216.998X一1148752.21,r二0.9981.图3(b)结果说明7一1菌实验样品中有一个峰的保留时间为6.519而n;图3(c)结果显示的是番茄红素标准品加7一1菌实验样品的测定结果,保留时间6.379而n处并未见两个峰,且峰面积较未加标准品的实验样品增加明显,可以认为7一1菌实验样品中该处出现的峰与番茄红素标准品是同一种物质,而且达到基线分离要求.样品中含量大的主峰保留时间为5.265而n,其物质的确定,有待于进一步研究.利用回归方程和峰面积计算得9号培养基培养第3期钱卫,等:光合细菌中番茄红素的研究115的7一l菌中每1009菌干重番茄红素的含量为398.7mg.每升9号培养基发酵液可得4.149湿菌体、1.019干菌体和4.03mg番茄红素.本实验探讨了利用光合细菌进行工业发酵生产番茄红素的可行性,精确测定了发酵液和菌体中这种色素的含量,并获得了较为满意的发酵结果,为今后利用光合细菌大规模生产番茄红素开辟了一条新途径,并提供了相应的参考数据.参考文献:【1」成坚,曾庆孝.番茄红素的性质及生理功能研究进展【J〕.食品与发酵工业,2仪刃26(2):75一79.[2」ClintonSK.Lye卿ne:ehe而stIy,biolO群,all(】ilnplieationsfor11zux皿1healtll出lddisease[J」.NutrRev.1998Feb;56(ZRl):35一51.【3]孙庆杰,丁霄霖.番茄红素的保健作用与开发「J」.食品与发酵工业,199723(4):72一75.【4」Hoffillallll1allclWeisb世gerJH.1lltenlatio耐sylllposlulnon theroleoflycopeneandtonlat〔,p以It】etsindiseasep此vention[J].CancerEpide而olBi0lllarkersprev.l期A吧;6(8):麟3.【5〕李琳.番茄红素的研究进展[J〕.食品科学,2(XX),21(5):8一11.【6]谭新平.番茄红素与癌〔J」.天然产物研究与开发,2(X)l,13(4):71一74.〔7」徐伟编译.番茄红素对人体健康的潜在作用【J].国外医学卫生学分册,1998,25(12):81一84.LS〕郭清泉,陈焕钦.几种具有开发前途的功能性天然色素【J」.广州食品工业科技,2(X)218(2):36一38.【9〕孙庆杰,丁霄霖.番茄红素稳定性的初步研究【J」.食品与发酵工业,1998,24(2):47一52.【10」邓宇,张卫强.番茄红素提取方法的研究【J〕.现代化工,2(X)2,22(2):25一29.【11]王强.反向高效液相色谱法同时测定番茄中5种类胡萝卜素仁J].色谱,1997,15(6):5抖一536.〔12〕齐国鹏,赵锁奇.超临界流体色谱分析番茄红素「J〕.分析化学研究简报离刃2,30(12):1477一1450.[13」WeaverpF,W习1JD,GestH.CllalacterizationofRh司叩-seudolnollase叩sulate仁J〕.航hMieobiol,l盯5,l仍:2以-216.(编辑:于善清)(上接第110页)〔6〕王淑芳,王峻岭,赵彦修.胆碱脱氢酶基因的转化及转基因番茄耐盐性的鉴定【J〕.植物生理学报,2(X)1,27(3):248一252.【7]郭光沁,夏光敏,李忠谊,等.小麦原生质体来源细胞的体细胞胚发生及植株再生【J].中国科学(B辑)1991,34(4):438一朝3.仁8〕刀aGM,‘zy,Heex,etal.T扭11昭e苗ePlalltRe罗nera-tion枷1llwheat(阮~aest~L.)Mediat仪l场乃脚bac-teri,tl切l动滋ic璐【J].Actapllytopllysiologieasinica,l!列列〕,25(l):22一28.【9〕Cheng,zM,阮hnuITJA,Kal犯山IJA,etal.Timentinasan alnativeantibioticforsuPPressionofAgrol犯etentnnturnefaciens生mlls公〕nnation[J〕.Planteellre卯rt,l卯8,17(s):创石一“9.[10〕。