第一部分Appendix XVI C. Efficacy of Antimicrobial Preservation (Ph. Eur. general text 5.1.3)如果药物制剂本身没有足够的抗菌活性，那么就应该加抗菌防腐剂。

在药品正常的储存和使用过程中，液体制剂特别是多剂量液体制剂，尤其需要添加防腐剂。

这样不仅可以阻止细菌繁殖、限制微生物污染；还可以防止细菌污染给患者身体带来的危害和对药品本身的污染。

抗菌防腐剂在GMP中不能被替代。

抗菌防腐剂的效果根据药物制剂的组成成分的不同、防腐剂加入的形式的不同、或使用容器或封口的不同而增强或减弱。

在最终的包装容器内的制剂，我们需要验证它在整个有效期内的抗菌活性。

这样才能保证在贮存过程中抗菌活性不会减弱。

样品从最终容器中取出时就需要立即进行验证了。

在药物制剂发展期间（注：研发Research & Development，D就是发展期间，将活性分子变成处方制剂的过程），应该需要证明药物制剂本身的抗菌活性。

如果没有就需要添加合适的防腐剂、或防腐剂能够保护制剂免于遭受微生物污染的不良效果和在贮存和使用过程中细菌的繁殖。

抗菌活性应该通过以下一系列测试来证实。

这些测试并不用于常规的对照目的。

测试抗菌防腐剂的有效性测试包括三方面内容：一、不论最后的包装容器是什么，都需要用规定的接种物，也就是合适的微生物对制剂进行攻击。

二、在规定的温度下贮存已接种制剂。

三、在一段时间间隔内抑制容器内的样本生长，然后计数这样被除去的样本中的菌数。

在测试条件下，如果在规定时间和温度下，接种后制剂中的菌落数有重大的下降或没有增加，那么药物制剂中防腐剂的作用就是可以接受的。

接受标准（即在规定时间内减少微生物的数量）随着制剂类型的不同而不同。

因为制剂类型的不同所达到的保护的程度也不同。

（见表5.1.3-1/2/3）。

微生物检测（见附录二）绿脓假单胞杆菌A TCC 9027; NCIMB 8626; CIP 82.118.金黄色酿脓葡萄球菌ATCC 6538; NCTC 10788; NCIMB 9518; CIP 4.83.白色念珠菌A TCC 10231; NCPF 3179; IP 48.72.黑曲霉A TCC 16404; IMI 149007; IP 1431.83.使用单菌株攻击而且设计微生物可以在合适的地方补充其他菌株或品种，这样就能代表可能的制剂污染。

推荐大肠杆菌(A TCC 8739; NCIMB 8545; CIP 53.126)用于所有的口服制剂，鲁氏接合酵母(NCYC 381; IP 2021.92)用于所有的含有高浓度糖的口服制剂。

接种菌的准备检测的开始阶段，在琼脂培养基B(2.6.12)表面接种细菌或在没有额外抗生素添加(2.6.12)的琼脂培养基C表面接种真菌。

不论是细菌还是真菌都应该是近期生长的贮存培养的特定微生物。

在30-35°C下培养细菌18到24小时，温度控制在20-25°C下；培养白色念珠菌48小时，温度控制在20-25°C下，培养黑曲霉1周或直到可以看到孢子形成时。

在微生物存活下来之后，恢复到最佳状态之前需要进行次培养。

但是，我们推荐他们的数量应该维持在最低值。

为了收获细菌和白色念珠菌培养基，我们使用浓度是9g/l的无菌氯化钠灭菌悬浮液用来把培养基表面分散和转移到一个合适的容器中。

添加充足的悬浮液来减少微生物计数到大约108个微生物/ml。

收获黑曲霉培养基，我们使用浓度时9g/l的氯化钠R和0.5g/l的聚山梨醇酯80 R然后通过添加同样的溶液调整孢子数到108个/ml.立刻从每个混悬液中除去合适的样品，然后通过平板计数或膜滤法(2.6.12).算出每个混悬液的每毫升集落生成单位。

这个计算是为了决定接种物和在测试中使用的基线。

混悬液应该立刻使用。

方法为了计数在已接种制剂中能繁殖的微生物，我们使用琼脂培养基来分别培养最初的微生物。

接种一系列将会被检验的制剂容器，每个容器都装有一种检测微生物的混悬液，使接种后每毫升或每毫克制剂中有105-106个微生物。

接种混悬液的体积不能超过制剂体积的1%。

彻底的搅拌以保证分布均匀。

维持已接种的制剂在20-25°C，避光。

在0小时和合适的时间间隔（依据制剂剂型的不同制定），从每个容器中除去适量的样本，通常是1ml或1g，然后通过平板计数或膜滤法(2.6.12)算出繁殖的微生物的数量。

保证剩余的制剂的抗菌活性都通过稀释、过滤或使用特定的灭活剂而消除。

当使用稀释过程时，要适当考虑少数存活下来的可繁殖微生物的弱敏感性。

当使用灭活剂时，通过合适的对照可以确认支持检测微生物生长的系统的能力。

该过程在验证能否减少可繁殖微生物的数量时是有效的。

接受标准抗菌活性的接受标准见表5.1.3.-1/2/3。

即对比可繁殖微生物数量的对数级减少和接种时的数量。

表5.1.3.-1. –非口服和眼用制剂*NR:没有恢复对数级减少6h 24h 7d 14d 28d细菌 A 2 3 - - NR*B - 1 3 - NI** 真菌 A - - 2 - NIB - - - 1 NI**NI:没有增加A标准是应该达到的推荐效果。

在评定案例中，如果A标准没有达到，比如有不良反应增加的风险，那么就要满足B标准。

表5.1.3.-2.-局部给药对数级减少2d 7d 14d 28d细菌 A 2 3 - NIB - - 3 NI真菌 A - - 2 NIB - - 1 NIA标准是应该达到的推荐效果。

在评定案例中，如果A标准没有达到，比如有不良反应增加的风险，那么就要满足B标准。

表5.1.3.-3.-口服制剂对数级减少14d 28d细菌 3 NI真菌 1 NI上表的标准是应该达到的推荐标准。

第二部分SC I J. Efficacy of Antimicrobial Preservation该部分提供了抗菌防腐剂效果测试的目的、范围的背景信息。

本部分的附录提供了一些测试方面的指南。

1．抗菌防腐剂效果的测试（属于附录的XVIC）在药典中是非强制性的。

在欧洲药典中与这部分内容相似的是EP的第5部分和个论部分的相关参考检查。

非强制性给个药在保证与药典一致的检查上提供了灵活性。

2．药典的检查方法是给生产企业保证产品质量方面提供了一个模板和基础，生产企业可以建立满足自己特殊要求的方法。

检测过程目的在于提供一个方法，在制剂的研发期间，生产企业可以评估任何制剂内添加防腐剂的有效性。

在BP的内容内，附录XVI C用于定义合适的抗菌防腐剂这与general notice的第二部分的相关notice一致。

3．如果在研发期间，一个全数据、可比较的不同防腐剂系统评估是有用的，那么这个过程就会在附录中扩充。

比如，并入额外样本时间会允许对微生物死亡率做评估。

4．测试的目的在于这些制剂的申请。

因为制剂可能会促进使用过程中微生物污染的可繁殖性的增强。

这基于这种前提下，防腐剂不仅用于保护制剂防止细菌污染，而且还用于识别未经灭菌的制剂的初始污染菌的角色。

使用过程中的污染通常与多剂量制剂有关，包括灭菌和非灭菌。

初始污染菌与非灭菌制剂有关，包括单剂量和多剂量制剂。

5．欧洲药典给出了非口服制剂、眼用制剂、局部给药制剂和口服制剂的标准。

耳用制剂的标准和这些局部给药的制剂的标准是一致的，因此保持两种剂型标准的一致。

6．对非口服制剂、眼用制剂和局部给药制剂，欧洲药典正文通常包括了两个标准（A和B）。

标准A是推荐达到的，也就是说，这代表了普遍的可接受的标准。

7．对特定的制剂，比如，解酸剂和特定的生物制品，这些标准不太可能被接受，除非在其他方面的上的代价相同或更大。

备选标准应该满足这个条件：生产厂家和主管当局达成一致，而且也考虑到了所有相关的特殊品种。

非口服制剂、眼用制剂和局部给药制剂的标准B采用了欧洲药典委员会成员国的意见。

这些意见形成的指南是最低标准，任何备选的标准都不能低于此。

8．就像在第二段中提到的，药典的检测方法目的在于提供一个框架，而这个框架是有可能对不同的制剂形成合适的检测方法。

在药典中详细说明检测的各个方面是不合适的。

下面的增补有一些关于检查方法的重点并对检测的实际操作方面提供了额外的指南。

增补（Annex）9．有一些点被认为是检测过程偏差的源头。

这可能会导致检测结果出现偏差。

因此一个明确和充分的检测方案是必要的。

增补中会讨论这些点。

10. 检测微生物和培养基维持：需要引起注意的可能的偏差源应该考虑，来源、年纪、培养基的贮存；也要考虑在冻干菌株收集培养基（贮藏培养基）和用于接种制剂微生物混悬液（检测混悬液）之间通过的微生物数量。

推荐把贮藏培养基培养，然后整除冻干或贮存在液体氮下。

同样推荐亚培养的使用作为混悬液的检测在贮存培养基中不应该超过5个通过。

11．制剂接种：需要引起注意的潜在偏差应该包括培养基介质和接种制剂的方法。

接种物：接种制剂和未接种制剂按一定比例均匀混合。

附录XVIC说明检测混悬液应该立刻进行。

我们推荐一旦准备好了检测混悬液不能贮存超过8小时，而且温度应该保持在2°-8°。

12．检测容器：值得强调的是，正像在附录中说明的那样，不论是否可能，制剂应该被接种而且接种在原始的容器中（市场包装）。

但是，同时，转移到一些其他容器中也是必要的，比如，为了达到接种的混合均匀，应该仔细考虑选择的检测容器。

容器的特点会影响它自身的稳定性，像一些检测容器的材料、形状、容积和封口的形式都会产生影响。

容器的材料不能影响制剂，比如，在过滤和吸附过程，就不应该产生影响。

特别需要注意的是制剂pH值的改变可能也会显著影响防腐剂的活性。

表面光滑、瓶颈宽的容器会比较容易通过和搅拌；我们推荐用于乳状或有粘性的制剂。

13．检测过程：检测条件，比如：贮存温度和样本时间在附录XVIC中给出。

推荐检测温度应该在20 °到25°，不论是否可能，我们都推荐在不同检测过程中尽量保持温度不变。

14．存活数计算：附录明确指出了接种时的数量作为基线，然后计算可生殖微生物的减少。

15．防腐剂的失活：当残余的抗菌活性被除去时，不论是使用灭活剂或者是稀释，都需要通过合适的对照来确定系统支持检测微生物生长的能力。

这些对照应该刺激检测条件而且计数有效。

在设计对照时，合适的目标是恢复能力，比如应该设置70%的恢复值。

16．结果的表达：检测标准中的“没有增加”应该是在之前的特殊样本时间计数没有超过接种时的计数。

预计，在短时间的时间间隔内达到需要的计数下降的标准就是，防腐剂维持微生物菌群数不变或略低。

附件二绿脓假单胞杆菌的检测：待检测绿脓假单胞杆菌的制备方法同2.6.12描述的通用方法一致。

使用10ml或数量上相等的1g或1ml，接种到100ml肉汤培养基A上，混合均匀后在35-37°C培养18-48h。