反相高效液相色谱（RP-HPLC） 分析方法的建立
什么是色谱？
色谱是一种建立在一定的科学理论基础上的分离方 法（工具、手段）。
除色谱之外，经典（常见）的分离方法： 蒸馏、离心、电泳、过滤、沉淀、萃取等等
色谱
是一种高效能 的分离方法
色谱分析
以一定的科学理论为基础，在高效能的分离基 础上，结合先进的检测方法而建立的现代分析 方法。
tR1 tR2 分离度的公式：
R
t R 2 t R1 1 ( W 2 W1 ) 2
R：分离程度的量度 简称分离度
影响分离度的因素：k、α及n
分离度方程：
k 2 1 n R k 1 4 2
是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之 间作用的强弱
HPLC的基本配置及流程
HPLC色谱柱
数据处理系统
溶剂
手动/自动 进样器 色谱泵 检测器
废液
HPLC的仪器配置
溶剂 数据处理系统 泵系统 自动进样器 色谱柱及柱温箱 检测器
色谱的发明人——茨维特（M. S. Tswett）
俄国科学家茨维特1903年利用物质的吸附原理 ，开创了应用吸附原理分离植物色素 的新方法。
1906年正式命名
色谱法；Chromatography
30年代开始广泛研究和应用
主要是气相色谱及薄层色谱
高效液相色谱法的广泛应用始于70年代
色谱的发明人
俄国科学家
M. S. Tswett
正式命名“色谱”的文献中的一段话
什么情况下使用HPLC？
一般情况下HPLC不是分析方法的首选 分析方法选择的大致程序（以药典分析方法为例）：
样品情况的了解：
测定成分的数量以及性质相似程度：
单一成分的测定，最简单，随着测定成分的增 加，分析的难度增加；
组分性质的相似程度越高，分析的难度越高。
问题：组分性质的相差越大，分析的难度越低，是否 越有利于多组分分析？
查阅有关的文献资料
文献资料——有：
在文献的基础上，调整、改善。
不排除在文献基础上全面创新。
文献查阅时应注意的基本内容
液相色谱实验所需的基本参数 样品预处理方案 对照品（标准品）的配制方法 流动相：种类及配比，等度或梯度？ 固定相：色谱柱类型、颗粒大小及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器及相应参数：如紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量 以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称 色谱分析条件。
理论塔板数计算公式：
tR n 16 W
2
tR n 5.54 W h/2
2
理论塔板数n ：描述组分被保留的程度以及色谱 峰谱带展宽的程度。 塔板数越大，柱效越高。
tR = 5
W = .5
W=2
2
t n 16 R W 5 n 16 .5 n 1600
查阅有关的文献资料
文献资料——无：
结合样品的情况，首先应作一些试探性的工 作。 （见后面）
评价高效液相色谱方法的标准
只有更好，没有最好！
问题：什么样的分离结果是好的？ 答：用尽可能少的时间和消耗（人力、物力、财 力等）满足分析的要求（准确度、灵敏度、分析 速度等）。
评价液相色谱方法的标准
理论塔板数n ：分离效率（柱效）的量度
tR n 16 W 5 n 16 2 n 100
2
2
2
tR与W 是一对矛盾，tR/W 可以很好地表达 这对矛盾的情况。
影响柱效的因素很多，可以从色谱理 论进行分析，如塔板理论、速率理论等， 具体内容参见有关教科书或专著。
评价液相色谱方法的标准
什么是色谱的分离度
滴定分析（原料药、制剂定量分析）
紫外可见光度分析（原料药、制剂定量分析）
薄层色谱（鉴别、有关物质检查等；半定量分析）
HPLC（中药饮片、中药制剂的鉴别或有关物质的 检查；复杂样品定量分析等）
什么情况下使用HPLC？
1、对分析结果、测定速度和效率的要求 准确度要求：准确定量（RSD<5％）
测定速度和效率：快速，单一或多组分测定。
的相对大小。 α ＝ k2/ k1
k
α是分离因子，描述两个被分离组份容量因子 n是理论塔板数，描述组分被保留的程度以及
色谱峰谱带展宽的程度
分离度是色谱分离中主要考虑的因素
除分离度之外，在设计色谱方法时，以下几个因 素也都要考虑： 灵敏度 成本 载样量
分析速度
溶剂损耗
容易使用（简单）
色谱柱寿命
根据评价液相色谱方法的标准， 进行试探性工作
什么是高效液相色谱法？
High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC 是一种区别于经典液相色谱，基于现代仪器方法 的高效能分析方法： 高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以 及高灵敏度、高选择性的检测器…… 广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业…… 在技术、理论及应用上已进入一个较高的水平， 并高速发展。
2、样品情况 样品的复杂情况：HPLC适用于复杂样品的分析， 如中药分析、环境分析、体内药
物分析、临床药物分析等。
HPLC方法建立的前期工作
样品情况的了解：
样品的种类（来源）：植物（中草药）、合成中 间体、生物样品（血液、尿液、组织匀浆等） …… 样品的种类决定了样品的复杂程度（基质影响） ，从而可初步判定测定的难易程度并且为分析方 法的确立设计一个大致的方向。
文献资料查询——无
根据评价液相色谱方法的标准，结合样品的情 况，作一些试探性的工作
一、根据了解的样品信息以及分析目的， 建立ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ品预处理方案
色谱分析样品预处理的主要目的
将待测物质有效地从样品基质中释放出来，制成便于 分析测定的稳定液体试样。如：中草药或中成药有效 （指标）成分分析；体液中药物或代谢物含量的测定 等。
待测成分的性质：极性、水溶性、脂溶性、酸碱性 等
对方法的建立，有重要的指导意义。
样品情况的了解：
待测成分的结构特征：
对色谱柱的选择具有一定的指导意义（不是很明 显）；
对检测器的选择具有指导意义， 如：含有生色团（助色团），紫外有吸收，特别 是芳香族化合物，可考虑使用紫外检测器
待测成分的含量：
决定对柱效的要求（柱效高，可有较低的检测限） 决定对检测器灵敏度的要求