作业指导书
O P E R A T I N G I N S T R U C T I O N S
小麦粉与大米粉及其制品中
甲醛次硫酸氢钠含量的测定
编号：XZJY087-00-2019
版本：第一版第0次修改
编制：审核：批准：
实施日期：
一、编制目的
为规范小麦粉与大米粉及其制品中甲醛次硫酸氢钠含量的测定方法，编制本指导书。

二、适用范围
本指导书适用于小麦粉与大米粉及其制品中甲醛次硫酸氢钠含
量的测定。

三、编制依据
GB/T21126-2007《食品安全国家标准小麦粉与大米粉及其制品
中甲醛次硫酸氢钠含量的测定》
四、实验原理
在酸性溶液中，样品中残留的甲醛次硫酸氢钠分解释放出的甲醛
水被提取，提取后的甲醛与2,4-二硝基苯肼发生加成反应，生成黄
色的2，4-二硝基苯腙，用正己烷萃取后，经高效液相色谱分析仪分
离，与标准溶液甲醛衍生物的保留时间对照定性，用标准曲线法定量。

五、试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB/T6682规定的一
级水。

5.1 试剂
5.1.1 正己烷：色谱纯。

5.1.2 37%盐酸、氯化钠。

5.1.3 36%-38%甲醛溶液。

5.1.4 Na2HPO4·12H2O。

5.1.5 磷酸氢二钠溶液。

5.1.6 2,4-二硝基苯肼（DNPH）。

5.1.7 乙腈。

5.1.8 乙醇。

5.1.9 微孔滤膜：0.45μm，有机相。

5.1.10定性滤纸。

5.2 试剂配制
5.2.1 正己烷：色谱纯。

5.2.2 盐酸-氯化钠溶液：称取20g氯化钠于1000ml容量瓶中，用少量水溶解，加少量水溶解，加60ml37%盐酸，加水至刻度。

5.2.3 甲醛标准储备液：取1ml36%-38%甲醛溶液，用水定容至500ml,使用前按GB/T2912.1-1998中的亚硫酸钠法标定甲醛浓度。

或者用甲醛标准溶液配制成40ug/ml的甲醛标准储备液，此溶液放置4℃冰箱中可保存1个月。

5.2.4 甲醛标准使用液：准备量取一定量经标定的甲醛标准储备液，配制成2ug/ml的甲醛标准使用液，此标准使用液必须使用当天配制。

5.2.5 磷酸氢二钠溶液：称取18gNa2HPO4·12H2O,加水溶解并定容至100ml。

5.2.6 2,4-二硝基苯肼（DNPH）纯化：称取约20g2,4-二硝基苯肼（DNPH）于烧杯中，加入167ml乙腈和500ml水，搅拌至完全溶解，放置过夜。

用定性滤纸过滤洁晶，分别用水和乙醇反复洗涤5次-6次后置于干
燥器中备用。

5.2.7 衍生剂；称取经过纯化处理的2,4-二硝基苯肼（DNPH）200mg，用乙腈溶解并定容至100ml。

5.2.8 流动相：乙腈=水混合溶液[V（乙腈）+V(水)=70+30]，用0.45um 孔径的滤膜过滤，备用。

5.3 标准品
甲醛标准储备液
5.4标准液的配制
5.4.1甲醛标准储备液：取1ml36%-38%甲醛溶液，用水定容至500ml,用甲醛标准溶液配制成40ug/ml的甲醛标准储备液，此溶液放置4℃冰箱中可保存1个月。

5.4.2甲醛标准使用液：准备量取一定量经标定的甲醛标准储备液，配制成2ug/ml的甲醛标准使用液，此标准使用液必须使用当天配制。

5.4.3甲醛标准系列溶液：分别量取0.01ml、0.25ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、4.00ml甲醛标准使用液于25ml比色管中（相当于0.0ug、
0.5ug、1.0ug、2.0ug、4.0ug、8.0ug甲醛）。

六、仪器和设备
6.1 高效液相色谱（HPLC）仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。

6.2 分析天平:感量0.0001g和0.01g。

6.3 高速离心机：转速不低于10000r/min。

6.4 恒温水浴锅：50℃。

6.5 固相萃取装置。

6.6 氮气吹干仪。

6.7 涡旋混合器。

6.8 具塞三角瓶：150mL/250ml。

6.9 研砵
6.10容量瓶：1000ml、500ml、250ml、100ml。

6.11比色管：25ml
6.12移液管：50ml、5ml、2ml、1ml。

6.13高速组织捣碎机。

七、分析步骤
7.1 试样制备
注:在采样和试样制备过程中,应避免试样污染。

7.1.1 色谱分析条件
化学键合C18柱，4.6mm×250mm;乙腈+水流动相，流速0.8ml/min；紫外检测器，检测器波长35nm。

7.1.2 样品前处理
精确称取小麦粉、大米粉样品约5g于150ml具塞三角瓶中，加入50ml盐酸-氯化钠溶液，置于振荡机上振荡提取40min。

对于小麦粉或大米制品，称取20g于组织捣碎机中，加200ml盐酸-氯
化钠溶液，2000r/min捣碎5min，转入250ml具塞三角瓶中，置于振荡机上振荡提取40min。

将提取液倒入20ml离心管中，于10000r/min 离心15min(4000r/min离心30min），上清液备用。

7.2 高效液相色谱测定
7.2.1液相色谱条件
（1）色谱柱 C18 柱，250mm×4.6mm[内径（i.d.）,5μm，或相当者。

（2）流动相：甲醇-水（70+30，V1+V2）。

（3）流速：1.0mL/min。

（4）柱温：40℃。

（5）波长：365nm。

（6）进样量：20μL。

7.2.2标准工作曲线的绘制
分别量取0.01ml、0.25ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、4.00ml 甲醛标准使用液于25ml比色管中（相当于0.0ug、0.5ug、1.0ug、2.0ug、4.0ug、8.0ug甲醛），分别加入2mL盐酸-氯化钠溶液、1mL 磷酸氢二钠溶液、0.5mL衍生剂，然后补加水至10mL，盖上塞子，摇匀。

置于50度水浴中加热40min后，取出用流水冷却至室温，准确加入5.0mL正己烷，将比色管横置，水平方向轻轻振摇3次-5次后，将比色管倾斜放置，增加正己烷与水溶液的接触面积。

在一个小时内，每隔5min轻轻振摇3次~5次，然后再静置30min，取10μL正己烷萃取液进样。

以所取甲醛标准使用液中甲醛的质量为横坐标，甲醛衍生物苯腙的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。

7.4样品测定
取2.0mL样品处理所得上清液于25mL比色管中，加入1mL磷酸氢二钠溶液、0.5mL衍生剂，补加水至10mL，盖上塞子，摇匀。

置于50℃水浴中加热40min后，取出用流水冷却至室温，准确加入5.0mL 正己烷，将比色管横置，水平方向轻轻振摇3次~5次后，将比色管倾斜放置，增加正己烷与水溶液的接触面积。

在一个小时内，每隔5min轻轻振摇3次~5次，然后再静置30min，取10μL正己烷萃取液进样。

以所取甲醛标准使用液中甲醛的质量为横坐标，甲醛衍生物苯腙的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。

八、分析结果的计算及检出限
8.1样品中甲醛次硫酸氢钠含量（以甲醛计）按式（1）计算：
C=(m1×50)/(m×2)
式中：
c-----样品中甲醛含量，单位为微克每克（ug/g）；
m1----样品中甲醛的实测值含量，单位为微克（ug）；
50----样品加提取液体积，单位为毫升（ml）;
2-----测定用样品提取液体积，单位为毫升（ml）；
m-----样品质量，单位为克（g）。

8.2 空白试验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。

8.3 方法定量限
本方法的定量限为2mg/kg。

8.4 回收率
在添加浓度2mg/kg~10mg/kg浓度范围内，回收率在80％~110％之间，相对标准偏差小于10％。

8.5 允许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值得15％。