第35卷第8期东 北 林 业 大 学 学 报Vol.35No.8 2007年8月JOURNAL OF NORT HE AST F ORESTRY UN I V ERSI TY Aug.2007产几丁质酶酵母菌的筛选与鉴定1)惠丰立 冯金荣 杨柯金 文祯中(南阳师范学院,南阳,473061) 摘 要 从番茄果实表面筛选到1株产几丁质酶酵母菌株CY-6,该菌株产生的几丁质酶对番茄镰刀菌果腐病菌(Fusarium oxysporum)有较强的抗菌活性并具有较广的抗菌谱。
形态及生理生化特征测定结果表明:菌株CY-6与伊萨酵母属(Issatchenkia)中的陆生伊萨酵母(I.terricola)种的特征基本一致;测定了该菌株的26S r DNA D1/D2区域序列并根据26S r DNA构建了系统发育树;在系统发育树中,菌株CY-6与陆生伊萨酵母形成一个类群,序列同源性高达99.6%。
因此,将菌株CY-6鉴定为陆生伊萨酵母。
关键词 菌株CY-6;几丁质酶;26S r DNA;系统发育分类号 S476Screen i n g and I den ti f i ca ti on of Ch iti n a se2Produc i n g Y ea st/Hui Fengli,Feng J inr ong,Yang Kejin,W en Zhenzhong(College of L ife Science and Technol ogy,Nanyang Nor mal University,Nanyang473061,P.R.China)//Journal ofNortheast Forestry University.-2007,35(8).-66～67,70A chitinase2pr oducing yeast is olate CY26was screened fr o m the surface of t o mat o fruits.The chitinase pr oduced by strainCY26could str ongly inhibit the gr o wth of Fusariu m oxysporu m and exhibited inhibiti on against a wide2range of p lant pathogenicfungi.Mor phol ogical,physi ol ogical and bi oche mical characteristics of strain CY26sho wed that the characteristics of strain CY26were essentially consistent with those of Issatchenkia terricola.The analysis of26S r DNA D1/D2do main sequence fr o m strainCY26suggested that strain CY26was clustered t ogether with I.terricola in the phyl ogenetic tree,and the sequence identity be2t w een strain CY26and I.terricola was99.6%.The result indicates that strain CY26bel ongs t o I.terricola.Key words Yeast CY26;Chitinase;26S r DNA;Phyl ogenetic analysis 果蔬采后的病害主要由病原真菌引起[1]。
长期以来,使用化学合成杀菌剂一直是控制果蔬采后病害发生的主要手段之一,但是随着人类对食品安全、环境保护和克服有害生物抗性等问题的日益重视,化学杀菌剂的使用正受到越来越严格的限制[2-3]。
因此,研究和开发控制果蔬采后病害的新方法,对于降低腐损率、控制农残量、确保食用安全和提高产品国际竞争力具有十分重要的意义。
几丁质酶(Chitinase,Ec.3.2.14)被普遍认为是一种与重寄生、抗病防卫反应有关的酶类,许多拮抗菌通过产生几丁质酶来降解病原菌细胞壁[4]。
因此,几丁质酶产生菌在果蔬采后病害防治方面有巨大的应用潜力。
近年来,酵母菌分泌的胞外几丁质酶在果蔬采后病害生物防治中的作用已引起人们的重视。
范青等人[5]利用膜毕赤酵母(Pichia m e m branefaciens Hansen)和季也蒙假丝酵母(Candida guillier m ondii)防治桃采后的真菌病害,发现这2种酵母菌产生的几丁质酶对桃软腐病菌(Rhizopus stolonifer(Ehrenb:Fr)Vuill)孢子萌发有明显的抑制作用。
本研究从番茄果实表面分离筛选到1株产几丁质酶酵母菌株CY-6,该菌株产生的几丁质酶对番茄镰刀菌果腐病菌(Fusarium oxysporum)有较强抑制作用,并对其进行了形态、生理生化鉴定及基于26S r DNA序列的系统发育分析。
1 材料与方法菌株CY-6是从番茄果实表面分离得到;番茄镰刀菌果腐病菌(Fusarium oxysporum)及其供试病原菌由本实验室分离保存。
1)河南省自然科学基金项目(0411032300)。
第一作者简介:惠丰立,男,1965年7月生,南阳师范学院生命科学与技术学院,教授。
收稿日期:2006年10月17日。
责任编辑:潘 华。
固体几丁质培养基:胶状几丁质15.0g、酵母粉5.0g、(NH4)2S O41.0g、M gS O4・5H2O0.3g、KH2P O41.36g、H2O 1L,pH为4.5;液体几丁质培养基:固体几丁质培养基不加琼脂;P DA培养基:马铃薯200g、葡萄糖15g、琼脂13g、H2O1mL。
菌株的分离筛选:从市场上购买新鲜的苹果、梨、桃、番茄等水果样品,分别取果皮组织5g,加入45mL液体几丁质培养基中,28℃180r/m in振荡培养48h。
取0.1mL稀释一定倍数的稀释液均匀涂于固体几丁质平板上,28℃培养6d后,挑取具有明显透明圈的菌株纯化,置于4℃保存。
将初筛菌株接种于50mL液体几丁质培养基中,28℃180r/m in摇瓶发酵72h后,测定发酵液几丁质酶活力。
几丁质酶活性测定:参照Ant oni o和Masarus方法[6-7]。
1mL胶体几丁质与稀释的1mL酶液放于50℃水浴保温1h,上清液中的还原糖按DNS法测定。
一个酶活力单位定义为每小时释放相当于100μg N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。
酶抗菌活性测定:采用打孔法[8]。
将供试病原菌接种于直径为9.0cm的P DA平板上,28℃培养2～4d,在菌苔周围1.0cm处打3个孔(d=0.5cm),孔中加入50μL质量浓度分别为100、200mg/L的几丁质酶,对照以等量的无菌水代替,继续培养2～3d,观察抑菌情况。
形态和培养特征:参照微生物学实验手册[9]对菌株CY-6进行形态和培养特征观察。
生理生化特征:参照微生物学实验手册和酵母菌的特征与鉴定手册[9-10],对菌株CY-6进行糖发酵、碳源同化、氮源同化、无维生素培养基生长等生理生化鉴定。
26S r DNA序列分析:参照白逢彦等方法[11]提取菌株CY-6基因组DNA,用引物NL1(5’-GCA T AT C AA T AA GCG G AGG AA AAG-3’)和NL4(5’-GGT CCG TGT TTC AAGACG G-3’)PCR扩增该菌株26S r DNA近5’端的D1/D2区域。
PCR扩增条件为94℃预变性,5m in,36个循环(94℃变性60s;56℃复性60s;72℃延伸90s),最终72℃延伸7m in。
扩增产物经纯化后,送上海生工生物工程技术服务有限公司双向测序。
测序结果用BLAST软件与Gen Bank中相关种属的26S r DNA序列进行比较,用DNAMANV4.0软件的Multi p le Sequence A lign ment进行26S r DNA同源性分析,并构建系统发育树。
2 结果与分析菌株的分离筛选:样品通过液体几丁质培养基富集后,于固体几丁质平板上进行初筛,筛选出46株几丁质酶产生菌,从中挑选出具有明显透明圈的菌株9株,分别编号为CY-1至CY-9。
9株初筛菌株的几丁质酶活性见表1。
从表1可知,在几丁质诱导下,9株初筛菌株均能产生几丁质酶,但不同菌株产酶水平相差较大,有2株菌株产酶活性较高且产酶性能较为稳定,其中来源于番茄果实表面的菌株CY-6几丁质酶活性最高,为2.41U/mL,因而选择菌株CY-6作为研究对象。
表1 9株酵母的几丁质酶活性U・mL-1 菌株酶活性菌株酶活性CY-1 1.86CY-6 2.41 CY-20.27CY-70.28 CY-3 1.34CY-80.26 CY-4 1.15CY-9 2.19 CY-50.26 酶的抗菌活性:将50μL质量浓度分别为100、200mg/L 的几丁质酶加入供试菌菌苔周围的培养基孔,继续培养2～3 d,观察抑菌情况。
结果发现,菌株CY-6产生的几丁质酶对番茄镰刀菌果腐病菌(F.oxysporum)菌丝生长有较强的抑制作用(图1);进一步研究其抗菌活性表明,菌株CY-6产生的几丁质酶对苹果霉心病菌、苹果黑点病菌和梨黑斑病菌等多种病原菌均有一定的抑制作用。
图1 几丁质酶对番茄镰刀菌果腐病菌的抑制作用1为无菌水;2为100mg/L几丁质酶;3为200mg/L几丁质酶形态和培养特征:菌株CY-6在麦芽汁液体培养基中,细胞呈卵圆形,细胞大小为(2.1～4.2)μm×(3.3～7.4)μm,无性繁殖方式为芽殖,培养液不形成璞,菌液混浊,有菌体自凝现象;在麦芽汁固体平板上菌落较厚,乳白色,边缘整齐;在Mcclary产孢培养基生成子囊,每个子囊有1～3个子囊孢子,子囊孢子呈圆形;在P DA培养基上,不形成假菌丝(图2)。
图2 菌株CY-6的细胞形态生理生化特征:菌株CY-6能发酵D-葡萄糖。
可利用L-赖氨酸和柠檬酸,不利用硝酸钾、蔗糖、D-半乳糖、L-山梨糖、赤藓糖醇、木糖醇和DL-乳酸。
在无硫胺素培养基上不能生长(表2)。
参照酵母菌的特征与鉴定手册[10]进行试验。
菌株CY-6的生理生化特征与陆生伊萨酵母(Issatchen2 kia terricola)几乎完全相同。
表2 菌株CY-6的生理生化特征特征结果特征结果D-Glucose+Xylit ol-K NO3-D L-Lactic acid-Sucr ose-Citric acid+D-Galact ose-L-lysine+L-s orbose-Gr oth of thia m in-Erythrit ol- 26S r DNA序列分析:以菌株CY-6总DNA为模板,用引物NL1和NL4进行PCR扩增,得到约600bp的PCR产物;菌株CY-6的26S r DNA D1/D2区域序列已向Gen Bank提交,其登录号(Accessi on nu mber)为DQ450883,序列长度为556bp。