陇东大学学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化生命科学与技术学院08生物技术班作者：指导教师：蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000)摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。

并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。

关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of theenzyme production conditions（College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China）Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃.Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization0引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。

目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株[4,10]。

我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。

本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。

对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。

研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。

1实验材料及方法1.1 实验材料与仪器1.1.1 实验仪器电热压力蒸汽灭菌锅全温振荡培养箱生化培养箱超净工作台电子分析天平离心机pH测量仪分光光度计水浴锅微波炉1.1.2 实验材料①样品：分别采自陇东学院污水处理厂附近，农田土壤及养殖场附近的土壤。

②主要试剂：脱脂奶粉，氯化钠（NaCl），蔗糖，碳酸钠，酪氨酸，尿素，琼脂粉，牛肉膏，蛋白胨，三氯乙酸，结晶紫，干酪素，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠③培养基种子斜面培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂粉20.0g，水1000ml，121℃灭菌20min，备用。

筛选培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂粉20.0g，脱脂奶粉25.0g，水1000ml，106℃灭菌6min，备用。

基础培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，水1000ml，121℃灭菌20min，备用。

④试剂配制0.4mol/L碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠42.4g，定容至1000ml。

0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液：称取三氯乙酸65.4g，定容至1000ml。

pH7.2磷酸缓冲液：称取磷酸二氢钠31.2g，定容至1000ml，即成0.2mol溶液（A液）。

称取磷酸氢二钠71.63g，定容至1000ml，即成1.2mol溶液（B液）。

取A液28mL和B液72ml，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1mol/L pH7.2的磷酸缓冲液。

2％酪蛋白溶液：准确称取干酪素2g，称准至0.002g，加入0.1N氢氧化钠10mL，在水浴中加热使溶解（必要时用小火加热煮沸），然后用pH7.2磷酸缓冲液定容至100ml即成。

配置后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。

100µg/mL酪氨酸溶液：精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1g，逐步加入6ml 1mol/L 盐酸使溶解，用0.2mol/L盐酸定容至100ml，其浓度为1000µg/mL，在吸取此液10ml，以0.2mol/L 盐酸定容至100ml，其浓度为100µg/mL的酪氨酸溶液。

此溶液配成后液应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。

1.2 实验方法1.2.1 菌株筛选富集：将从陇东学院污水处理厂附近，实验楼前植物园土壤及养殖场附近的土壤采集的土壤,分别称取5g土样，放入装有45ml无菌水的三角瓶中，37℃震荡培养24h。

初筛：将富集培养的菌液取1ml，用无菌水依次稀释到10-7，分别取10-5、10-6、10-7三个梯度各0.1ml土壤稀释液制成混菌平板，将培养皿放入37℃培养箱中培养24h[8,9]。

取出培养好的平皿，选择生长良好、试剂管号形态明显的单菌落，用无菌牙签挑种到牛奶筛选培养基上，每个平皿中接4-5个，37℃培养箱中培养24h。

挑选出能在牛奶筛选培养基上产生水解圈的单菌落，接种到斜面培养基上，放入冰箱冷藏。

复筛:从冰箱中取出初筛得到的菌株，转接试管斜面活化，37℃下恒温培养24 h。

各取1环，接种到装液量为20ml基础培养基的50ml三角瓶中，在37℃条件下摇床培养24h。

分别取各菌株发酵液10μl滴加在牛奶筛选平板中的滤纸片上(直径为12mm)，然后将培养皿放入37℃的培养箱中培养24h，取出后测量水解圈直径与菌落直径。

重复此过程3次，取平均值，选取水解圈直径与菌落直径差值最大的菌株作为出发菌株whr1。

1.2.2 蛋白酶产生菌酶活力的测定酶活测定原理：酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。

酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的初速度来表示。

测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度，即可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示。

蛋白酶可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。

酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂发生福林酚反应。

（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。

）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力[11]。

酶液的制备：从斜面培养基中取1环菌种于30ml基础发酵培养基中，在37℃、140rpm摇床上培养12h，再分别取1ml经12h培养的菌液于不同条件的液体培养基中培养24h，然后培养液于5000rpm离心10min取其上清液为酶液。

酪氨酸标准曲线的制作：取6支25ml的比色管，编号，按下表操作表1-1 制作酪氨酸的标准曲线测定步骤：取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1ml ，各加入0.4mol/L 碳酸钠5ml ，在各加入的福林试剂1ml 。

摇匀置于水浴锅中，40℃保温发色20min ，用722型分光光度计进行测定（波长660nm ）。

测三次，取平均值。

将1-6号管所测得的光密度（OD ）减去一号管所测得的光密度为净OD 值。

测定酶活方法：取25ml 比色管3支，每管内加入酶液1ml ，置于40℃水浴中预热2min ，再各加入经同样预热的酪蛋白1ml ，精确保温10min ，时间到后，立即再各加入0.4mol/L 三氯乙酸2ml ，以终止反应，继续置于水浴中保温20min ，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取25mL 试管3支，编号1、2、3，每管内加入滤液1ml ，再加0.4mol 碳酸钠5ml ，已稀释的福林试剂1ml ，摇匀，40℃保温发色20min 后进行光密度（OD ）测定。

空白试验同样取试管3支，编号（1）、（2）、（3），测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol/L 三氯乙酸2ml ，使酶失活，再加入酪蛋白。

1.2.3产酶条件优化产酶曲线测定：在50ml 基础培养基中，分别在37℃下培养0h 、6h 、12h 、18h 、24h 、30h 、36h ，测其酶活。

不同碳源对产酶的影响：在50ml 基础培养基中其他成分不变，选用4种浓度为1%的不同的碳源，分别为麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖，37℃ 140 rpm 培养最优时间，测其酶活。

不同氮源对产酶的影响：在50ml 基础培养基中加入最优碳源，氮源改用5种浓度为1.5%的不同的氮源，其他成分不变，分别是尿素、(NH 4)2SO 4、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，37℃以最优时间培养，测其酶活。

不同培养基初始pH 值对产酶的影响：在50ml 基础培养基中加入最优碳源、氮源，其他成分不变，选用5种不同的pH ，分别是pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9，37℃以最优时间培养，测其酶活。

不同温度对产酶的影响：在50ml 基础培养基中加入最优碳源、氮源，其他成分不变，采用最优pH 值，分别在31℃、33℃、35℃、37℃、39℃下以最优时间培养，测其酶活[6,9]。

2实验结果2.1 菌株筛选2.1.1 菌株的分离筛选将土样利用牛奶筛选培养基分离得到具有蛋白酶活性的菌株，选出其中水解圈较大的whr1号菌1 2 3 4 5 6 蒸馏水，ml 100µg/ml 酪氨酸，ml 酪氨酸最终浓度，µg/ml 10 0 0 8 2 20 6 4 40 4 6 60 2 8 80 0 10 100株进行后续实验，并斜面保藏。