收稿日期:2003-12-01　基金项目:国家重点基础研究发展规划资助课题(2002C B412306)水华蓝藻毒素研究概述胡宗达,周元清　(云南大学生态地植物研究所,云南昆明650091)摘　要:随着科技进步,发现的有毒种类越来越多,毒素分子结构的研究也越来越清楚。

在大量文献的基础上,综合介绍水华微囊藻毒素、水华束丝藻毒素和水华鱼腥藻毒素对动物的毒害、毒素结构、检测方法和去除方法,并讨论存在的问题。

关键词:水华蓝藻;藻毒素;检测方法中图分类号:X173 文献标识码:A 文章编号:1006-947X (2004)03-0008-04 蓝藻(Cyanophyta )是生物界中一类古老且十分特殊的生物类群,分布广泛,适应力强,在腐烂物质、水体表面或底层皆有分布。

其重要繁殖场所之一是淡水,尤其是富营养化淡水湖泊。

淡水湖泊中常见蓝藻主要有微囊藻(Microcystis )、鱼腥藻(Anabaena )、颤藻(Oscillatoria )、聚球藻(Syne 2chococcus )、层理鞭线藻(Mastig oclaminosus )等。

目前已知产生毒素的淡水蓝藻约12属26种[4],其中易形成水华的常见种有铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa )、水华鱼腥藻(Anadaena flos -aquae )和水华束丝藻(Aphanizomenon flos -aquae )。

这3种蓝藻可分为有毒品系和无毒品系。

滇池是蓝藻水华污染相当严重的淡水湖泊之一,认识了解蓝藻毒素及其检测和去除方法,具有重要的现实意义。

本文综合介绍水华微囊藻毒素、水华束丝藻毒素和水华鱼腥藻毒素对动物的毒害、毒素结构、检测方法和去除方法,并讨论存在的问题。

1　水华蓝藻毒素1878年Francis 首次发现某些淡水“水华”蓝藻引起动物中毒死亡的现象。

Schwimmer 、Schwim 2mer 及G orham 等分别综述报道了北美洲湖泊、水库和池塘中的水华蓝藻导致动物中毒的事例[19]。

在欧、亚、非、南美洲等气候相似地区也有类似中毒死亡现象发生。

111　微囊藻毒素(MCY STs )微囊藻毒素主要是在Microcystis 、Anabaena 、Oscillatoria 、N ostoc 等属中的种类产生[26]。

属于一种肝毒素或一种细胞内毒素。

完整细胞没有毒性,在衰老、死亡或破裂后毒素才释放出来,表现毒性。

11111　微囊藻毒素淡水藻类中,毒性最强、污染最广、最严重的是蓝藻门。

目前已肯定的有毒藻类有铜锈微囊藻、水华鱼腥藻、水华束丝藻、阿氏颤藻、泡沫节球藻及念珠藻等。

这些藻类不只产生一种毒素,如环境发生变化,一种藻类可产生几种毒素。

蓝藻门中几个属产生的次生代谢产物可分为两类。

一类是肝毒素,主要包括七肽微囊藻毒素、五肽节球藻毒素和m otpurin 等,以微囊藻毒素为代表;另一类是神经毒素,主要是钠通道阻断蛤蚌毒素及类似物[24]、后突触神经类毒素和高类毒素、有机磷胆碱酯酶抑制毒素等[25],以鱼腥藻毒素为代表。

11112　微囊藻毒素对生物的影响MCY STs 主要以肝脏为靶器官。

动物经灌喂或腹腔注射后,破坏细胞内的蛋白磷酸化平衡,改变多种酶活性,引起肝脏病变,造成一系列生理紊乱。

中毒症状主要表现为虚弱、呼吸沉重、皮肤变白、呕吐、腹泻、毛立和嗜睡等。

如猴子的中毒症状为昏迷、肌肉痉挛、呼吸急促、腹泻等,在数小时或几天内死亡[11]。

赵雄飞(1994)用九山湖和金针湖采集的铜绿微囊藻,经BG 11培养基培养,抽取和分离毒素,对小白鼠腹腔注射。

小白鼠出现呼吸沉重、步履蹒跚、昏睡、最后死亡并出现眼珠发白,肝脏淤血呈深紫红色等症状。

证实九山湖铜绿微囊藻产生的毒—8—云南环境科学　2004,23(3):8-11 C N53-1093/X ISS N1006-947X素对小白鼠有毒性作用,与PCC7820中毒素一样,为肝毒素,而注射金针湖微囊藻的则对小白鼠无害,说明在铜绿微囊藻不同品系中含有毒和无毒品系,原因可有是遗传因素和生理生态因素或二者兼有的缘故[22]。

程凯等(2000)在武汉市解放公园的池塘采样,用腹腔注射法对小白鼠进行试验,再次验证铜绿微囊藻能产生微囊藻毒素,并得出其毒性的大小和水华发生时序有正相关关系。

说明毒素的产生具有阶段性变化。

产生这一现象可能是因为他们之间有某种内在联系[2]。

微囊藻水华具有季节性,毒性变化也常出现季节性差异[3]。

在夏秋季,微囊藻水华大量形成,死亡后将其毒素释放到水体中,引起野生动物和家畜间歇性或重复性的中毒死亡。

人饮用有一定含量的微囊藻毒素淡水时,可引起肝损伤、急性胃肠炎、腹泻及肝癌等症状[23],如1996年在巴西发生的微囊藻毒素血透析导致死亡的著名事件[21]。

家畜及野生动物食用微囊藻后出现腹泻、乏力、厌食、嗜睡、甚至死亡等现象。

微囊藻毒素对鱼类的肝、肾也有毒害作用[16],还对Hela细胞和Verox细胞的生长有抑制和毒性作用[15]。

这些事实说明微囊藻毒素对生物生息繁衍会造成极大威胁。

11113　微囊藻毒素的结构微囊藻是世界淡水湖泊中最常见的水华蓝藻,在我国很多淡水湖泊(如武汉东湖、江苏太湖、安徽巢湖、云南滇池、大理洱海等)中都有蓝藻水华爆发现象。

Louw认为,微囊藻毒素是一种具有强烈慢性肝脏中毒特征的生物碱。

Hughes等(1958)发现并分离得到铜绿微囊藻NRC-1有毒品系。

Bishop等(1959)对铜绿微囊藻NRC-1品系的毒性作全面研究,发现这种微囊藻毒素是由7种氨基酸组成的小分子环状多肽[19],为单环结构:D-丙氨酸-L -X-赤-β-甲基-D-异天冬氨酸-L-Y-Adda -D-异谷氨酸-Mdha。

其中Mdha是一种特殊氨基酸;Adda为3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯-4,6-二烯酸;X和Y为两种可变L氨基酸(图1-2)[13,17]。

目前已鉴定约有65个微囊藻毒素变式[11,21],其中多数毒性较高,如MCY ST-LR、MCY ST-RR和MCY ST-Y R等。

11114　微囊藻毒素产生与环境、遗传因子的关系(1)微囊藻毒素产生与环境密切相关。

Utkilen和Bickel的研究证明,环境对微囊藻毒素产生的影响,光最为重,其次,温度也起着重要作用(图3)[3]。

此外对滇池水华铜锈微囊藻和绿色微囊藻研究中发现在低光条件下毒素产量较高,且光强对毒素的影响与温度有关[14],低温条件(8～20℃)微囊藻毒性强,但这并不是微囊藻适宜生长的温度,高光照射下,温度对其毒素几乎无影响。

此外,不同种类营养盐的作用也不一样。

如P、Fe、Zn影响非常明显,在BG11培养基中降低铁和锌的浓度,产量显著提高,而Al、Cd、Cr、Cu、Mn、Ni和Sn等对其毒素产量无明显影响[18]。

图1　微囊藻毒素的分子结构图2　微囊藻毒素通式图3　不同季节微囊藻水华毒性变化(2)生物遗传主要受DNA控制。

Otsuka等研究了有毒和无毒微囊藻间的关系; Ding研究了上海淀山湖水华爆发时蓝绿藻提取物的遗传毒性[11];Meiβner于1996年发现微囊藻有毒和—9—水华蓝藻毒素研究概述 胡宗达无毒株多肽合成酶基因的同源DAN 序列。

这些研究表明其毒素的产生受遗传因子影响。

Dittman 和Nishizawa 的研究也证明这一点[7]。

112　水华束丝藻毒素(Aphanizomenon flos -aquae toxins )水华束丝藻产生毒素使牛中毒死亡现象早在20世纪初就有报道,但只针对现象而言,无实质性研究进展。

到20世纪60年代初,才真正对水华束丝藻毒素进行研究和探讨。

1978年,Shimizu 研究证明是一种贝毒物(四氢嘌呤生物碱),毒性极强,如注射小鼠,不超几分种小鼠就会发生中毒反应,毒性均大于微囊藻毒素和鱼腥藻毒素[19]。

金传荫等(9981)用Carmichael 先生1980年在美国New Ham pshire 的Durham 附近的小池塘中采集的水华束丝藻NH -5株,进行BG 11培养基培养,提取毒素,采用AOAC 小鼠生物检测法对纯种昆明小鼠(18-22g ,雄性)腹腔注射小鼠出现腹式呼吸,后抽搐并不自主地跳动,最后死亡。

通过研究,证实水华束丝藻NH -5株能产生麻痹性的贝毒素[5]。

水华束丝藻毒素是一种作用于细胞膜水平上的肌肉神经抑制剂,作用机理被认为是通过阻止钠离子流的作用势能,最后抑制神经传导,这些作用机理与石房哈毒素作用机理一致。

113　水华鱼腥藻毒素(Anabaena flos -aquae toxins )水华鱼腥藻毒素是一种细胞外毒素,溶于水,对光、热和碱表现不稳定性,而它的盐酸化合物则是稳定的。

每当温暖季节来临,许多富营养化淡水湖泊常出现有毒水华鱼腥藻爆发现象。

动物饮用此类水后,中毒死亡时有报道。

Ols on ,Firkins 和R ose 对其研究最早。

G orham 等人在1964年首次报道了在加拿大Saskachwean 和Burton 湖泊中形成的无毒水华里分离出有毒品系(NRC -44-1)。

这些毒素能够使小鼠出现麻痹、颤抖、轻度抽搐、最后死亡。

后来Devlin ,Biggs ,Dryden ,Carmichael 等已对水华鱼腥藻毒素的化学结构和毒性进行过研究[19]。

乔明彦等(1994)报道牛饮用达赉湖有毒鱼腥藻水华出现中毒死亡的现象。

后来在此湖采样,研究得知主要是微囊藻和鱼腥藻,并用新鲜鱼腥藻(2914mg/ml )灌喂体重为34kg 的健康羊,发现呼吸困难、腹部肌肉抽动、摇头、流涎等症状,进行切片诊断得知是“中毒性闹病”,而且有轻度肝损伤。

这个试验再一次证实了水华鱼腥藻毒素的毒性[12]。

图4　水华鱼腥藻毒素和水华束丝藻毒素的化学结构2　水华蓝藻毒素的检测方法及去除方法211　目前藻毒素的检测方法主要有生物测试法、化学分析法、免疫检测法、生物化学分析法及酶学方法等[1,11]①生物测试法:采用对小鼠进行灌喂或腹腔注射来鉴定藻毒素的毒性,能较为粗略地判断提取物是否有毒性。

具有操作简便,结果直观、快速等优点,但无法准确定量分析。

②化学分析法:包括高效液相色谱法(HP LC )、HP LC -UV 、HP LC -MS 、PC L 、CE -MS 、毛细管电泳(CE )、薄层色谱法(T LC )及气相色谱法(G C )等,对藻毒素可进行精确的定性、定量检测。

③生物化学分析法:主要包括酶联分析法(E LIS A )、蛋白磷酸酶抑制分析法(PPI A )、免疫检测法、比色法蛋白磷酸酶抑制分析等,此类方法工作原理简单易行、分析速度快、灵敏度较高,但不能对毒素起到良好的鉴别作用。

上述方法方兴未艾,有利有弊,具体实践中要灵活应用,取长补短。