端粒酶RNA亚基的发现
Daniel Gottschling利用TPE效应设计出实验,筛选酵母RNA亚基 基因: 把URA和ADE连个基因通过遗传重组的方法置入端粒区域,由于 TPE效应,URA和ADE不表达. 酵母只能在含有uracil的培养基中生长,且克隆是红色的.
再转入cDNA表达库,某些调控端粒长度的基因通过过表达可以改 变端粒的长度.如果端粒长度变得足够短,TPE效应就会消失,URA 和ADE两个基因就会启动表达. 这种短端粒的酵母能够在不含有uracil的培养基中生长,并且酵母克 隆显示出白色
端粒酶催化亚基
端粒酶既然能够利用RNA模板亚 基来复制DNA,那么很容易推测 这个蛋白亚基可能具有RNA dependent DNA polymerase 活性(依赖于RNA的DNA聚合酶 活性),即逆转录酶活性.更进一步 说,它的蛋白质序列里应该包含逆 转录酶特有的结构区域.
用四膜虫的核抽提液与体外的端粒DNA进行温 育,试图在体外检测到这个酶的活性,看到端粒 的延伸.
Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的实验
经过不断优化条件,尤其是把底物换成体外合成的高浓度 的端粒DNA后,Carol通过曝光x光片,清楚地看到了“酶” 的活性:在测序胶的同位素曝光片上,端粒底物明显被重 新加上了DNA碱基,而且每六个碱基形成一条很深的带, 与四膜虫端粒重复基本单位为六个碱基正好吻合.
人工染色体
端粒序列的发现使Jack Szostak有机会把 线性质粒末端连接到四膜虫的端粒DNA ， 然后再倒入酵母细胞中。奇迹发生了：线 性质粒不再被降解，而是在细胞内稳定存 在并复制。 这是人工染色体的最早雏形，它使得DNA 的大片段克隆成为可能，后来为人类基因 组测序工作立下了汗马功劳。
端 粒----稳定线性染色体的末端结构
Def. 存在于染色体末端的一段 特殊的DNA重复序列
端粒和端粒结合蛋白组成核蛋 白复合物，广泛存在于真核生 物细胞中；
不同种类细胞的端粒重复单位 不同，大多长约5—8bp;
端粒的结构与功能具有保守性.
端粒的功能
保护染色体 末端
A
B
防止染色体 复制时丢失
决定细胞寿 命
Cபைடு நூலகம்
E
TPE效应
固定染色体 位置
为什么染色体的自然末端不容易相互融合？
Assumptions
染色体的自然末端不同于非正常的DNA断裂末 端,它有一个特殊的结构来避免染色体之间的相 互融合.
科学家Hermann Muller将这种特殊结构命名 为端粒(Telomere,在希腊语中,telos表示末 端,meros表示片段).
Experiments
D
端粒酶活性的发现
Liz女士的实验室在研究四膜虫端粒序列的过程中还发现 了一个有趣的现象:带着四膜虫端粒DNA的人工染色体 导入到酵母后,被加上了酵母的端粒而不是四膜虫的端 粒序列.
由于端粒是由重复序列组成的,当时人们普遍猜想同源重 组是延伸端粒补偿染色体末端隐缩的机制.但是同源重 组只能复制出更多本身的序列,为什么在四膜虫端粒上 加的是酵母的端粒序列而不是四膜虫本身的序列呢?这 个现象是同源重组无力解释的.
Nobel Prize in Medicine Awarded for Creaking DNA Puzzle
端粒酶亚基
Liz实验室与Tom Cech合作,对端粒酶活性进一步定性. 用RNA酶处理样品,降解样品的RNA→酶活性消失 用蛋白酶消化→酶活性消失
端粒酶RNA亚基的发现
RNA亚基有一段RNA序列正好和四膜虫的端粒DNA序 列互补,端粒酶正式利用RNA亚基的这段序列作为模板 重复复制出端粒DNA
Jack Szostak
Elizabeth Blackburn
四膜虫
人工染色体
四膜虫
四膜虫是一种特殊的模式生物， 有两个细胞核。小核很稳定，含 5对染色体，用于生殖传代；而 大核在接合细胞的发育过程中， 染色体可断裂成200—300个小 染色体，端粒非常丰富。
Elizabeth Blackburn
Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的实验
这种酶活性不依赖于DNA模板,只 对四膜虫和酵母的端粒DNA进行 延伸,而对随即序列的DNA底物不 延伸;并且该活性不依赖于DNA聚 合酶.
而同源重组对序列没有特异性要求, 并且依赖于DNA聚合酶的活性.
至此,她们澄清了这两种假说,证明 了有一种酶来延伸端粒DNA,即端 粒酶(telomerase)
Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的实验
四膜虫在接合细胞的大核发育过程中,大核产生了 非常丰富的小染色体,每一个小染色体都在末端 加上了端粒,可以推测:如果“酶”的假说成立,此 时细胞内的酶活性应该是非常高的.
Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的实验
【精品文档】端粒和端粒酶
Assumptions
1.复制前联体、环化（linear→circle） 2.发卡结构 3.可变末端（alterable terminal）多个短重复序列
(short repetitive sequences) 4.蛋白质干预
Puzzles 2
1939年,潜心玉米遗传性状研究的 Barbara McClintock (因发现玉米的转座子获诺贝尔学奖)注意 到:在减数分裂后期偶然产生的染色体断裂很容易重新 融合起来形成“桥”,在紧接着的有丝分裂中,这种染色 体“断裂---融合---桥---断裂”的循环不断继续。
1978年，Elizabeth Blackburn利用四膜虫纯化 了rDNA,以rDNA为模板通 过体外合成掺入dNTP的实 验，推断出四膜虫的染色体 上有由许多重复的5’CCCCAA-3’六碱基序列组 成的特殊结构区域，此区域 即端粒。
人工染色体
1980年，Elizabeth Blackburn在会议上对这一 重大发现的报告,引起了Jack Szostak的极大兴趣。 他那时候正试图在酿酒酵母 中构建人工线性染色体，让 它能够在细胞中像自然染色 体一样复制。但当环状质粒 线性化并转入细胞后，很快 就被降解掉。