收稿日期： !""# $ #" $ #% 作者简介： 董欣荣 （#&’( $ ） ， 女， 内蒙古五原县人， 硕士， 主要从事 微生物油脂方面的研究 )
郑州工程学院学报 第 "% 卷 " ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 瓶速度依菌种的类型和菌体的生长速度而定 ! "#$#% 摇瓶培养 &’’ () 的三角瓶内装 $$’ () 的液体发酵培 养基， 接入种子液 " * % ()， 温度、 转速同上， 培养 时间比种子液培养延长 $ * " + ! !"! 菌体收集 酵母、 毛霉均采用 , ’’’ - . (/0， $& (/0 离心收 集! !"# 菌体油脂的检测 "#%#$ 苏丹黑染色法定性分析菌体油脂 方法 $： 培养好的菌体按常规方法涂片、 热固 定， 用苏丹黑 1 染色 $& (/0， 倾去染料， 二甲苯冲 洗至洗脱液无色， 再用沙黄复染 " (/0， 水洗、 吸干 后镜检 ! 细胞和菌丝呈红色， 菌体内的脂肪颗粒呈 ［,］ 蓝黑色 ! 方法 "： 将滤纸覆盖在菌体上， 用手轻压， 把 沾有菌体的滤纸置于 &’2 下干燥 "’ (/0 后， 将其 浸入 苏 丹 染 色 液 中 染 色 "’ (/0， 再将滤纸浸入 脱色重复两次， 观察滤 3&4 乙醇中脱色 % * & (/0， ［$%］ 纸上菌体颜色 ! ［$,］ "#%#" 苏丹黑染色法定量分析菌体油脂 培养好的菌体经离心， 蒸馏水洗去所含营养 物， 制成与培养液等体积的悬液， 取 " 支试管， 各 加入 & () 该悬液， 一管用苏丹黑染色， 以另一管 未染色细胞作对照， 在 &5’ 0( 测定吸光度， 由此 来确定油脂浓度 ! !"$ 前处理方法 "#,#$ 酸处理 取一定量的菌体， 用 ,’ 倍体积的 $ (67 . ) 盐 酸配制成菌悬液， 使细胞壁 $"$2 下维持 $’ (/0， ［$&， $8］ 水解， 达到破壁的目的 ! "#,#" 反复冻融 ［5］ 将菌体置于冰箱 9 "’2 冷冻过夜后取出融 化， 反复冻融 % 次， 通过慢速冷冻过程中细胞体内 生成的大冰晶及反复冻融的过程来破坏细胞壁 ! "#,#% 超声波破壁 在超声波清洗器中加入水， 将菌体悬液置于 玻璃烧杯内， 以水为介质， 处理 $& (/0， 通过超声 波高频振动产生的空穴效应达到破壁的目的 ! !"% 油脂提取 ［$;］ "#&#$ 氯仿:甲醇法 "#&#" 索氏抽提法 图% 斯达克油脂醇母苏丹黑染色 图" 粘红醇母苏丹黑染色 使用方法 $， 分析酵母菌体油脂， 结果见图 $ 至图 & 的酵母菌体油脂照片 !
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土生假丝酵母苏丹黑染色
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结果与讨论
菌体油脂的观察结果 图, 啤酒酵母 $ 苏丹黑染色
第#期 董欣荣等： 几种真菌油脂的检测与提取 ’ ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 该方法的缺点是发酵液中生物量浓度高于 （本实验中最大浓度达 &( - . /） ， 直 "! $ ’( - . / 时 接测量吸光度就有较大的误差， 这是因为细胞核 中的染色质会对测量产生影响， 因此必须把样品 液稀释到一定程度， 或加入盐酸处理后再进行染 色 % 此外， 该方法还要求样品液均匀稳定， 实验中 卷枝毛霉经发酵培养， 菌丝缠结成团， 不能很好地 分散于水中形成均匀的悬液， 所以该方法只适于 测定酵母这类菌体的油脂浓度 % 图! 啤酒酵母 " 苏丹黑染色 !"! 前处理方法对油脂得率的影响 ’0’0# 土生假丝酵母 土生假丝酵母经摇瓶培养 ! 1， 离心收集， 混 匀， 用吸水纸吸去一定的水分， 分别称取约 ! - 的湿 菌体 ! 份， 用以下几种不同的前处理方法处理， 在 称干重， 采用氯仿3甲酵法 （添加 &(2 下真空干燥， 一定量的水） 提取油脂， 计算油脂得率， 结果见图 4%
第 !( 卷第 # 期 郑州工程学院学报 BCD ) !(， EC ) # !""! 年 ( 月 FCG>AHD CI JKLAMNKCG OAPQ@QGQL CI /LRKACDCMS 4H> ) !""! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 文章编号： （!""!） #*’# $ #*!& "# $ ""#+ $ "%
图4
前处理方法对土生假丝 酵母油脂得率的影响
’0’0" 卷枝毛霉 卷枝毛霉 ’0""(5 经摇瓶培养 & 1， 离心收集， 用吸水纸吸去一定的水分， 称取约 #( - 的湿菌体 采用不同的前处理方法处理， 在 &(2 下真空 ! 份， 干燥， 称干重， 用索氏抽提法提取油脂， 计算油脂 得率， 结果见图 5 % 图& 苏丹黑染色法定量测定土生 假丝酵母菌体内脂标准曲线 只要得到少量培养好的菌体， 即可 根据图 &， 用苏丹黑染色法确定吸光度， 再从标准曲线估算 油脂浓度 % 这种方法方便快捷， 前后只需 ’( $ )( 不需要通过物理或化学方法破碎细胞壁和进 *+,； 行常规的溶剂抽提 % 只要确定了吸光度和油脂浓 度的标准曲线， 就能很快地得出结果 % 用该方法预 测菌体的含油量， 能够及时决定取舍， 避免了后序 工作中许多不必要的劳动， 也节省了时间 % 图5 前处理方法对卷枝毛霉
从图 # $ ! 可以看出， 土生假丝酵母、 粘红酵 母、 斯达克油脂酵母均有明显的脂肪粒或油滴， 且 粘红酵母的脂肪粒位于胞外的一圈， 土生假丝酵 母的脂肪粒分布于假菌丝内； 斯达克油脂酵母菌 体内油脂呈油滴状， 因而胞内油脂是片状， 而不是 粒状， 观察起来也不如脂肪粒清晰 % 显然啤酒酵 母、 金啤酵母菌体为红色， 很少有脂肪粒或油滴 % 对于毛霉， 由于菌丝缠结成团， 且其细胞壁常常难 以脱色而被苏丹黑染为浓重的蓝黑色， 再加上生 长状况不同， 染色状态也不稳定， 因此无论方法 # 还是方法 " 对毛霉苏丹黑染色都不成功 % !"# 苏丹黑染色法定量测定菌体内脂的分析 苏丹黑染色法测吸光度确定菌体油脂浓度的 结果见图 & % 油脂浓度的值来源于粗脂肪的重量 与培养液体积的比 %
"
前言
真菌油脂在成分组成上类似于植物油， 主要
是中性油脂、 游离脂肪酸、 类脂物及不皂化物 ) 真 菌合成油脂的速度、 油脂积累量和脂肪酸组成， 因 所用原料、 培养基条件、 产油菌株的不同而有显著 由于个体微小， 菌体 ) 对于产油微生物， 量少不足以检测， 完全依靠传统的提取， 检测动植 物油 的 方 法， 将使实验建立在高成本的基础之 上
郑州工程学院学报 第 #! 卷 3 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !"##$% 油脂得率的影响 从实验结果来看， 用超声波和盐酸破壁效果 都不错， 但用盐酸破壁操作复杂， 所需时间较长， 大规模生产时会对环境造成污染； 冷冻处理比反 复冻融破壁效果略差一些； 而以真空干燥处理效 果最差 & 考虑到菌体结构上的差异， 可采用不同的 方法处理 & 比如毛霉的细胞壁比较坚韧， 不易破 坏， 可以同时采用几种方法， 如同时采用超声波和 冷冻的破壁手段， 先进行超声波处理， 再反复冻融 而对于土生假丝酵母， 直接用超声波破 ! ’ ( 次； 壁 )( *+, 就可达到要求 & !"# 提取方法对油脂得率的影响 提取方法主要有干法 （乙醚索氏抽提） 和湿法 （氯仿-甲醇抽提） 两种 & 由于含油率及油脂得率的 计算以干菌体为基础， 干燥是必须的步骤， 这就使 得干 法 操 作 更 加 方 便 & 然 而， 对于含水率高达 用湿法提取更加适合， 抽提 .(/ ’ 0$/ 的湿菌体， 更加彻底， 也节约能源， 但实验步骤多， 操作复杂 & 表) 土生假丝酵母与卷枝毛霉 !"##$% 的提取测定
［(］
差别
［#， !］
， 而且事倍功半 ) 此时观察法
［+］
成为首选 ) 真
菌尤其是霉菌具有坚韧的细胞壁， 使我们不能直 接获得油脂或者只能获得少量油脂， 因此， 提取前 用前处理方法破坏菌体细胞
［%态还是结合态也在
［*］ 很大程度上决定着采用的提取方法 ， 这些都会 ［’］ 导致真菌油脂的实际产量有所差别 )
几种真菌油脂的检测与提取
董欣荣#，曹 健#，赵 斌!，许伟华#
（郑州工程学院 #, 生物工程系，!, 粮油食品学院，河南 郑州 +%""%!） 摘要： 通过对几种产油真菌的培养， 详细介绍了菌体油脂的观察、 检测方法— — —苏丹黑染色法， 并以土生假丝酵母和卷枝毛霉 (,!!"- 为例进行了前处理方法及油脂提取方法的分析 ) 结果表 明： 苏丹黑染色法中的定性观察法和定量检测法均能成功地适用于酵母菌； 超声波处理、 盐酸 处理是较为有效的前处理方法， 在实际工作中， 超声波处理和反复冻融结合使用效果好； 酵母 菌及毛菌油脂的有效提取方法为氯仿.甲醇法 ) 关键词： 真菌油脂；前处理；提取；分析 中图分类号： /0*+# 文献标识码： 1 （中 国 菌 种 保 藏 中 心） ，油 脂 酵 母 !,"’"+ （ 中国菌种保藏中心） ， 啤 1%2*(3)40 0-".543% !,#(&" （ 郑州工程学院 6"))&".*(3)40 )4.47%0%"4 微生物实验室提供） ， 啤酒酵母 ! 6"))&".*(3)40 （郑州工程学院微生物实验室提供） )4.47%0%"4 8 #,#,! 毛霉 卷 枝 毛 霉 9’)*. )%.)%#4++*%$40 (,!!"（ 234. ， 卷 枝 毛 霉 9’)*. )%.)%#4++*%$40 (,(*-" （ 234. 22） 22） ) !"# 培养基 #,!,# 斜面培养基 大麦芽汁培养基， 马铃薯葡萄糖培养基 ) #,!,! 液体发酵培养基 麦芽汁或马铃薯培养基， 合成培养基 （不同菌 种所用的合成培养基参见文献 ［- 5 ##］ ） ， 半合成 培养基 （%"6 麦芽汁或马铃薯培养基， %"6 合成培 养基） ) 酒酵母 #