综诉利用红豆杉细胞培养生产紫杉醇的技术路线及其影响因素、对策摘要红豆杉细胞培养是工业化生产紫杉醇的很有前景的途径之一。
综述了红豆杉细胞培养过程中外植体的选择、愈伤组织的诱导、培养方式、生物反应器及培养动力学等方面的最新研究进展,并对今后利用细胞培养工厂化生产紫杉醇尚需解决的问题作了简略的探讨。
关键词红豆杉;细胞培养;紫杉醇紫杉醇是从红豆杉科红豆杉属植物中分离出的一种二萜类化合物,对卵巢癌、子宫癌、乳腺癌等十几种癌症具有很好的疗效,它目前已在临床上作为乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌的一线用药。
然而从天然生长的红豆杉树中提取紫杉醇无法满足需求,药源不足已成为限制紫杉在临床中大量应用的瓶颈。
植物细胞培养具有不破坏自然资源及不受自然条件限制等优点。
目前利用细胞大量培养技术生产紫杉醇的研究已经进入到生物反应器放大阶段，红豆杉细胞培养工业化生产紫杉醇有望获得突破。
为解决紫杉醇的药源问题，人们从以下几个方面进行了研究：全合成、半合成、人工栽培、真菌生产和植物细胞培养等方法。
其中细胞培养法由于具有下述优点成为人们进行商业生产的优选方法：(1)能够确保产物无限、连续、均匀地生产，不易遭受病虫害、季节等因素的影响；(2)可以在生物反应器中进行大规模培养，并且通过控制环境条件提高紫杉醇产量；(3)所得产物比从植物体内直接提取简单，可以大大简化分离和纯化步骤; (4)除提供紫杉醇外，还可以生产出前体及其他有抗癌活性而原植物所不含的化合物。
技术路线 1 愈伤组织的诱导与培养1. 1 外植体的选择外植体对于愈伤组织的诱导率、生长状况等具有重要影响。
红豆杉属植物愈伤组织的诱导相对比较容易。
根、茎叶、树皮、形成层、大配子体、种子胚、假种皮、幼苗胚轴、芽等都可作为外植体诱导出愈伤组织,但不同外植体其愈伤组织的诱导率及愈伤组织生长情况差别很大。
茎段的诱导效果较好,而树皮、叶片较差。
1. 2 培养基及激素的选择对于红豆杉愈伤组织的诱导与培养,多数报道的适宜培养基为基本的或经改良的B5 【1】培养基。
然而,也有不同的研究结果报道。
以南方红豆杉芽为外植体,最适诱导培养基为MS 【2】,对愈伤组织的增殖、驯化和紫杉醇的积累则以B5 为最佳。
1. 3 培养条件黑暗条件有利于愈伤组织的诱导、生长和紫杉醇的形成,紫杉醇的产量高于光照条件下的3 倍。
愈伤组织诱导与培养的适宜温度为20～25 ℃。
对于细胞悬浮培养而言，培养基的主要成分相同于固体培养基，只是去掉了琼脂,大多使用B5培养基。
悬浮培养中，使用的碳源大多为蔗糖，果糖对紫杉醇含量的提高有一定的作用，而半乳糖对细胞生长作用显著。
高浓度蔗糖（40 g.L-1)能提高培养细胞紫杉醇的含量。
果糖能提高一般细胞紫杉醇的含量，但对高产培养物来讲，果糖没有作用。
蔗糖有利于细胞生长，而葡萄糖抑制紫杉烷的合成。
糖的补充有缩短悬浮细胞生物量增加时间的作用。
植物激素对悬浮培养细胞的生长和紫杉醇含量有较大的影响。
2,4-D一般抑制次生代谢产物的合成，促进细胞生长。
2,4-D 浓度在1.0～3.0 mg.L-1之间时，培养细胞中紫杉醇的含量与2,4-D浓度呈负相关。
适当改变生长素与激动素比例可提高紫杉醇含量,当其比例为5～10时，紫杉醇含量较高。
1. 4 愈伤组织褐变现象的控制红豆杉属植物愈伤组织的诱导、继代培养过程中,细胞会分泌大量的棕色色素物质,这些色素物质的积累会影响愈伤组织生长,愈伤组织受毒害而逐渐转为暗褐色至黑色,这种现象称为褐变。
1.5其它培养条件在黑暗条件下，悬浮细胞生长较好，紫杉醇产量高于光照条件下的3倍。
接种量对细胞生长和紫杉醇合成有明显影响。
实验证明，细胞接种量不应低于70 g(FW).L－1，当接种量低于50 g.L－1时，生长停止。
接种量在80～110 g.L-1时，生长速度没有明显差异。
当接种量从1.5增加到3 g.L-1(DW)时, 紫杉醇含量增加30%, 6 g.L-1(DW)接种量时，可在较短时间内获得较多的生物量，但接种量进一步增大,紫杉醇合成则受到抑制。
不同浓度氧气、二氧化碳和乙烯对细胞生长和紫杉醇产量有很大影响。
低浓度氧气（体积比10%）促进紫杉醇产生，高浓度二氧化碳（体积比10%）则表现为抑制作用。
最佳气体组合为：10%氧气、0.5%二氧化碳及5×10-6乙烯。
高浓度氧气促进钙的吸收和抑制磷的吸收，说明气体能改变细胞对营养物质的吸收分配，直接影响细胞生长和紫杉醇的产生。
影响因素2、1 无机盐对红豆杉细胞生长及紫杉醇生产影响通过对氮、磷等无机盐在红豆杉细胞悬浮培养中的吸收状况，无机盐对细胞常量及紫杉醇产量的影响研究表明：培养液中的磷酸盐在培养初期迅速、大量地被吸收；中其时几乎没有吸收；但是到培养后期则又可检测出磷酸盐的存在。
说明此时细胞中的磷酸盐向外渗透到了培养液中；与此相反，硝酸盐的吸收率则较为缓慢，尤其在培养的中期。
培养基中氮源影响红豆杉愈伤组织的生长和紫杉醇的含量。
培养基中硝酸根离子浓度高有利于红豆衫愈伤组织的生长,而氨根离子浓度高则抑制愈伤组织的生长,但可提高紫杉醇的含量。
2、2 培养基的pH 值的影响培养基的pH 值是影响红豆杉愈伤组织生长及紫杉醇含量的又一重要因素。
对东北红豆杉而言,较高pH 值对生长有利,pH 值为7. 0 时愈伤组织生长状态最好,但pH值为6. 0 时愈伤组织中紫杉醇的含量最高;对南方红豆杉而言,pH 值为5. 5 时对愈伤组织的生长最为有利,pH 值为7. 0 时紫杉醇的含量最高。
可见,有利于愈伤组织生长的pH 值不同于次生代谢产物合成所需的适宜pH 值。
紫杉醇的产量取决于生物量的增加和其中紫杉醇含量两方面的因素,因此,用细胞培养法生产紫杉醇时需综合考虑愈伤组织生长和紫杉醇形成对各种培养条件的不同要求。
在培养基中添加适宜浓度的有机物可以提高愈伤组织的诱导率和生长状况。
添加10 %的椰子汁(CM) 可提高外植体愈伤组织的诱导率和生长势,添加10 %的椰子汁或0.1 %的水解酪蛋白(CA) 可使红豆杉的愈伤组织生长得更快,并且可使愈伤组织维持更长时间,其中CM 的效果比CA 的效果更好[11 ] 。
盛长忠等【3】的研究也表明培养基中添加CA 能促进南方红豆杉愈伤组织的生长,但高浓度(0. 5 %) CA 不利于紫杉醇的积累,以0. 1 %为宜,既能促进愈伤组织的生长,又不影响紫杉醇的含量。
2、3 培养基中激素、激素的浓度及激素之间的组合对愈伤组织的诱导和培养的影响培养基中激素、激素的浓度及激素之间的组合对愈伤组织的诱导和培养起着重要作用。
适宜浓度的NAA、2 ,42D、62BA、赤霉素( GA3 ) 、IAA、IBA、等都可促进红豆杉愈伤组织的诱导和生长,但在效率上存在差异。
对中国红豆杉进行的实验表明,添加2. 0 mg/ L的2 ,42D 较易诱导出愈伤组织,2. 0 mg/ L的NAA 也具有较好的诱导效果, IAA 单独使用不能使外植体形成愈伤组织;对于愈伤组织的生长而言,4. 0 mg/ L的NAA 效果最好,2 ,42D 的效果次之, IAA 的效果最差【4】。
江洪如等【5】研究表明,2 mg/ L的2 ,42D 的诱导效果优于同样浓度的NAA。
盛长忠等[12 ]也报道对南方红豆杉,2 ,42D 比NAA 更有利于愈伤组织的形成。
但也有研究表明,NAA 激素组合比2 ,42D 组合更有利于愈伤组织的诱导,在B5 培养基中添加2. 0 mg/ L NAA + 1. 0 mg/ LIAA + 0. 5 mg/ L KT ,东北红豆杉幼茎的愈伤组织诱导率可达100 %【6】。
产生上述不同结果,可能与红豆杉的品种、培养基的种类及激素之间的组合等因素有关。
由于2 ,42D 具有致癌活性,因此作为药源的红豆杉细胞培养中宜使用其它种类的激素代替。
培养方式 3. 1 细胞悬浮培养和愈伤组织相比,悬浮培养的细胞与液体培养基充分接触,养分供给充分,因而细胞生长周期短,细胞生物量增加快,是植物细胞培养主要的方式。
3. 2 固定化培养固定化培养具有可连续培养、反应效率高、易于调控等优点,成为植物细胞培养研究中的一个重要方法。
3. 3 两相法培养两相培养技术能够使产物及时转入第二相,可以防止反馈抑制或被细胞内部的分解酶将产物降解,从而提高产物的产量;通过有机相的不断回收及循环使用,有可能实现细胞的连续培养,提高培养效率。
3. 4 两步法培养细胞的快速生长与紫杉醇的大量合成并不同步进行,而且,这两过程对培养条件的要求也不一致。
因此,把红豆杉细胞培养过程分为细胞生长和红豆杉合成两个阶段,可望解决上述矛盾。
目前,虽然红豆杉细胞培养生产紫杉醇取得了很大的进展,紫杉醇生物合成途径基本清楚,细胞的生长和紫杉醇的产量已基本得到解决,有的已达到中试规模,但植物细胞遗传与生理的不稳定性、细胞间的不一致性使得在培养工程中高产细胞系不能实现高产率,而且易发生遗传变异产生其他代谢产物,另外,植物细胞培养技术较复杂,对反应器要求较高,阻碍了通过细胞培养工业化生产紫杉醇的实现。
今后在高产细胞系的选育、适合植物细胞大规模培养的新型生物反应器、合成紫杉醇的代谢调控、利用现代分子生物学技术构建高产的基因工程细胞株等方面需加强研究,以早日实现红豆杉细胞培养工业化生产紫杉醇。
【1】B5培养基。
B5培养基的主要特点是含有较低的铵，这是因为铵可能对不少培养物的生长有抑制作用。
经过试验发现，有些植物的愈伤组织和悬浮培养物在MS培养基上生长得比B5培养基上要好，而另一些植物，在B5培养基上更适宜。
【2】MS培养基。
MS培养基是目前普遍使用的培养基。
它有较高的无机盐浓度，对保证组织生长所需的矿质营养和加速愈伤组织的生长十分有利。
由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存、消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响离子间的平衡。
【3】盛长忠,王淑芳,王宁宁,等. 南方红豆杉愈伤组织培养的研究[ J] 药,2000 ,31(2) :130.【4】李伯林,赵群华,卢山,等. 红豆杉植物愈伤组织的培养及其紫杉醇形成的初探[ J] . 南京大学学报,1995 ,31 (3) :424.【5】江洪如,涂艺声. 红豆杉愈伤组织的诱导和培养[ J] . 江西科学,1998 ,16 (1) :57.【6】王森林,胡风庆. 东北红豆杉愈伤组织培养研究[ J] . 辽宁大学学报(自然科学版) ,2002 ,29 (1) :75.贵州大学化学与化工学院生物工程071班姓名：詹贤超学号：070811110185。