（二）规范操作
操作技术熟练、工作经验、操作者、进入超净工作台 的物品表面。
（三）条件合适
培养基种类、激素种类和浓度、其他添加物、外植 体来源、生长发育状态、培养条件。
形态发生和植株再生 建立的无菌培养物在适宜的离体环境 中，生长发育（形态发生）形成完整的 小植株。 离体材料的形态发生的途径： 器官发生 体细胞胚胎发生
（5）生根培养 刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降
低或不加细胞分裂素浓度，提高生长素浓度，促进芽苗
生根，提高其健壮度。 （6）炼苗移栽
选择生长健壮，有3～5条根的生根苗进行炼苗，移
栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮荫。当苗 完全成活后，再移向大田。
拟定培养方案
外植体预处理
外植体无菌接 种
形态发生和植株再生
器官发生：芽或芽原基起源于培养组织中比较表 层的细胞，即外起源。根原基发生在组织较深处，即 内起源。两者之间一般没有什么联系，呈现单向极性。 胚状体发生：极大多数体细胞胚起源于单细胞， 形成的胚状体具有双极性，在其发育的早期阶段，在 方向相反的两端分化出茎端和根端，其维管组织与母 体植物或外植体的维管组织通常没有联系。胚状体维 管组织呈独立的Y形。
2、无菌苗的增殖
优缺点： 第一、二种途径的好处是增殖速度快，但会产生变 异， 第三种途径的好处是不会产生变异，能保持品种优 良特性，且方法简便，可在各种植物上使用，但增殖速 度不如前二者。 若用于育种，以第一、第二种途径有利，而用于良 种快速增殖，以第三种途径有利，主要是要保证良种的 优良品性，不产生变异。目前已广泛采用，每年每个芽 可增殖10万株乃至上百万株。
⑵腋芽增殖的原理
高等植物的每个叶腋中都有腋芽存在，通常由于 顶芽的存在，顶端优势阻止腋芽的生长，但在一定的 条件下可以使它生长，如除去顶芽或使用生长激素， 可以解除顶端优势，腋芽便不断分化和生长，逐渐形 成芽丛。 若反复切割这些腋芽和移植到新的培养基中继代 培养，就可在短期内得到大量的芽。
⑶影响增殖成功的关键因素
第二节 植物营养器官培养



植物根段培养 植物茎段培养 植物叶培养
一、离体根的培养
植物根段培养是指以植物的根切段为外植体进行培 养的技术。 （一）根无性系的建立 来自无菌种子发芽产生的幼根切段或植物根系经灭 菌处理后的切段，可以以两种方式进行培养，建立根的 无性繁殖系。
一、离体根的培养
1、根的直接增殖 1）根无性繁殖系的建立 将种子进行表面消毒，在无菌条件下进行无菌萌 发，待根伸长后从根尖一段切取长1.0cm的根尖，接种 培养基中。 这些根的培养生长很快，番茄根每天约生长10mm， 几天后发育出侧根。待侧根生长约一周后，即可切取 侧根的根尖进行扩大培养，它们又迅速生长出侧根， 又可切下进行培养，如此反复，就可得到从单个根尖 衍生而来的离体根的无性系。 2）培养条件：黑暗培养，温度为25—27℃
一、离体根的培养
3）培养基 离体根培养所用的培养基很多，多为无机离子浓 度低的White培养基，其他培养基如MS、B5培养基等也 可采用，但必须将其离子浓度稀释到2/3或1/2。
一、离体根的培养
4）培养方式 离体根的培养方式有三种类型。 第一种固体培养法，即将根尖接种在固体培养基 上，根依靠培养基中的养分和生长物质而不断生长。 第二种是液体培养法，把根尖接种在无琼脂的液 体培养基中，经常振荡使根获得充足的氧气。 第三种是固体-液体培养法，就是把根基部插入固 体琼脂培养基中，根尖浸在液体培养基中，根尖生长 而根不断的伸长和分枝。
（二）根、块茎、鳞茎的灭菌
生长在土中，灭菌困难，以受损伤。 灭菌前仔细清洗，加大灭菌剂浓度或延长灭菌时间。
无菌外植体的获得 （三）花蕾的灭菌
未开放的花蕾中的花药为花被包裹，处于无菌状态， 采摘后可直接灭菌。 70%酒精浸泡10-30s—0.1-0.2%氯 化汞浸泡3-10min，（或1%次氯酸钠浸泡10-20min）—灭 菌水冲洗3-5次—无菌滤纸吸干—分割—接种。
二、茎段培养


茎段培养是指对植物的带有一个以上定芽或不定芽的 外植体（包括块茎、球茎、鳞茎等在内的幼茎切段） 的无菌培养。 目的:1、快速繁殖，2、探讨茎细胞的分裂潜力和全能 性，以及诱发细胞变异，筛选突变体。 我们主要是介绍用于快速繁殖为目的的茎段培养。

茎段
茎尖取 材有限，可 采用带节或 不定牙的茎 段进行培养。
第三章 植物器官和组织培养
植物器官和组织培养的基本程序 植物营养器官培养 植物繁殖器官培养 植物组织培养
组织培养步骤图
（1）准备阶段 查阅相关文献，根据已成功培养的相近植物资料，结合 实际制定出切实可行的培养方案。 根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段 所需的培养基，并经高压灭菌或过滤除菌后备用。
（2）外植体的选择与消毒
选择合适的部位作为外植体，采回后经过处理，然后进 行消毒处理。
将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块， 或剥离出茎尖、挑出花药，接种到启动培养基上。
（3）启动培养 接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，促使 外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋 芽直接萌发形成芽。 将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原基 或形成胚状体，最后发育形成再生植株。 （4）增殖培养 分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的增殖培 养基经反复多次切割转接。 当芽苗繁殖到一定数量后，再将一部分用于壮苗生根， 另一部分保存或继续扩繁。进行脱毒苗培养的还要进行病 毒检测。
3、无菌苗的生根


这个阶段的目的是使再生的大量试管苗形成根系， 获得完整的植株，在前两阶段以长苗为目的，使 用的生长激素往往不利于生根的发生和生长，因 此在这个阶段，必须创造一个适于根的发生和生 长的条件。 主要是降低或除去细胞分裂素，而加入或增加生 长素。
影响生根成功的关键因素
①培养基的盐浓度 试管苗的生根，对基本培养基的种类要求不严， 一般的培养基都可用于诱导生根，但对其含盐浓度 要适量加以稀释。前面的几种培养基中，除White培 养基外，都富含N、P、K盐，它们都抑制根的发生。 因此，应将它们降低到1/2、1/3或1/4，甚至更低的 水平。就可得到理想的生根结果。
Murashige(1974)曾提出用组织培养法进行植物快速繁 殖三个阶段的概念， 第一阶段——外植体成苗； 第二阶段——繁殖体增殖； 第三阶段——移植于土壤中长根。 这三个阶段对于不同植物来说有不同的反应，应用于 草本植物是成功的，但对木本植物来说，最大的困难是

第三个阶段。
1、无菌苗的建立
茎段培养用于快速繁殖的优点
培养技术简单易行，繁殖速度较快，每年可增殖 105-1012株苗； 加速良种和珍贵植物的繁殖，芽生芽方式增殖的 苗木质量好，且无病，性状均一； 解决不能用种子繁殖的无性繁殖植物的快速繁殖 的问题，且可节省种株； 试管苗便于运输和防止种苗带菌传播，有利于国 际种质交流； 试管苗可用于保存某些难以用种子保存的种质资 源。
（四）果实和种子的灭菌
表皮有茸毛或蜡质，需在灭菌剂中加入几滴土温-80。 果实70%酒精浸泡数秒—0.1-0.2%氯化汞浸泡3-10min， （或1%次氯酸钠浸泡10-20min）—灭菌水冲洗3-5次—无 菌滤纸吸干—分割—接种。
初代培养物的建立 （一）无菌环境
培养基、接种器械、超净工作台、接种室环境、抗 生素物质（去除侵入组织内部的病菌。见表）
外植体形态发生形成完整植株的途径
（一）外植体-愈伤组织-完整植株。 具体又可分为三种： 1、愈伤组织-同时长芽和根-植株。 2、愈伤组织-茎-根-植株。 3、愈伤组织-根-芽-植株。 4、愈伤组织-体细胞胚-植株
（二）外植体-胚状体-植株。可从以下几种培养物中产生： 1、器官上发生。 2、愈伤组织上发生。 3、游离单细胞发生。 4、小孢子发生。 诱导胚状体比诱导芽数量多、速度快、结构完整。 （三）外植体-直接形成根与芽-植株。如茎尖培养
启动培养
分化出芽、胚 状体或原球茎
继代增殖培养
生根培养
炼苗移栽
成活供生产使 用
培养基配制灭菌
植物组织培养的一般程序
第一节
植物器官和组织培养的基本程序



无菌外植体的获得 初代培养物的建立 形态发生和植株再生 培养产物的观察记载
无菌外植体的获得 （一）茎尖、茎段、叶片的灭菌
清水冲洗，吸干—0.1-0.2%氯化汞浸泡2-10min， （70%酒精浸泡数秒，10%次氯酸钙浸泡10-20min或2% 次氯酸钠浸泡15-30min）—灭菌水冲洗3-5次—无菌滤 纸吸干—分割—接种。
⑶影响成功的关键因素
B、生长素 生长素虽不能促进腋芽增殖，但可改善苗的生长， 因此，许多种植物也都加入一定的生长素类物质。其中 使用最多的是NAA，依次为IBA、IAA和2，4-D，它们的 使用浓度多为0.5mg/L以下。
⑶影响成功的关键因素
C、GA GA对芽的伸长有促进作用，故常加入少量的GA，使 用浓度为0.5mg/L。 D、光照 光照条件也十分重要，这一阶段必须保持适当的光 周期(16小时光照)和光强(2000-3000Lux)，以利芽的再 生和生长。
一、离体根的培养
2、根的间接增殖 第一步在脱分化培养基上诱导形成愈伤组织，如胡杨 的根段培养，可诱导形成白色愈伤组织。 第二步在再分化培养基上诱导形成芽的分化，如胡杨 从绿色愈伤组织分化出小植株。
胡 萝 卜 根 培 养
一、离体根的培养
（二） 离体根生长的营养要求


1、无机成分 要求培养基中有全部必要元素， 因为它是离体生长所需要的，一般的为MS、B5培 养基。 2、氮源 氮源有铵态氮、硝态氮和可溶性有机 氮如氨基酸或酰胺等，其中以硝态氮的效果最好。 加入含各种氨基酸的水解酪蛋白，能促进离体根 的生长。
②生长素的浓度