0.9%NaCl溶液 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2 0 （ml）
考马斯亮蓝染液 5 5 5 5 5 5 5 5
蛋白质含量（μg） 0 10 20 30 40 60 80 100
A595
2．样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加 入合适浓度的待测样品，使其测定值在标 准曲线的范围内，测定方法同上，由样品 液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
3．若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈， 以免产生大量气泡而难于消除。
思考题
1． 说出你所知道的几种蛋白质定量测定的 方法，并与考马斯亮蓝染色法相比较各有 何优缺点？
2．根据下列所给的条件和要求，选择一种 或几种常用的方法测定蛋白质的浓度。 （1）样品不易溶解，但要求结果较准确； （2）要求在短时间内测定大量样品。 （3）要求很迅速地测定一系列试管（如30 支）中溶液的蛋白质浓度。
பைடு நூலகம்
分析讨论
1.纸膜尽可能剪得小一点，但可以拿出来的 程度。质量过重会影响结果。
2.饼干应尽量弄得碎一点，否则影响水分吸 收，导致误差。
3.从烘箱拿取是要小心不要将盖子打开，否 则会导致误差。
计算
样品的蛋白质含量（μg/g鲜重）=[查得的 蛋白质含量（μg） / [ 样品鲜重（g）]
注意事项
1. 如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min 内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。
2．测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于 比色杯壁上，不可使用石英比色皿（因不易洗去 染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用 少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿 决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
考马斯亮蓝G-250法有常量法和微量法两种。
Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高：蛋白质－染料复合物具有很高的
消光系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低 检出量为1ug蛋白质。据估计比Lowry法约高四倍，
（2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大 约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。 因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时 间。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
实验目的
了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理 掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作
步骤
实验原理
根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。 考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的复 合方法。考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状 态下呈棕红色，当与蛋白质结合后呈青蓝色。在 一定范围内，也就是当蛋白质含量在0~1000μg范 围内，蛋白质-色素结合物在595 nm下的吸光度与 蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。
仪器和试剂
1．仪器：分析天平；吸管0.1ml×1、1ml×2、5ml×1；试 管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml、1000ml各一个；
2．试剂： （1）0.9% NaCl溶液； （2）标准蛋白质溶液：称取10mg 牛血清白蛋白，溶于蒸 馏水并定容至100ml，制成0.1mg/ml 的原液。 （3）考马斯亮蓝G-250（0.01%）染液：称取0.1g考马斯亮 蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液不宜久存， 在常温中可放置1-2个月。 （4）样品液：取牛血清白蛋白0.1mg/ml 的溶液，用0.9% NaCl溶液稀释至一定浓度。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、 Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基 乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸 的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定 时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 γ— 球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰 物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 （SDS）和0.1M的NaOH，少量的去污剂可通过用 适当的对照消除，而必要时必须预先处理样品。
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用 Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未 知蛋白质的浓度。
操作步骤
1．0~100μg／mL标准曲线的制作： 取8支具塞试管，编号后，按下表加入
试剂，盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转 混匀，室温静置5min后，以管1为空白对照， 在595nm下比色测定。以标准蛋白质含量 （μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出 标准曲线。
管号
123 4 5 67 8
蛋白质标准液 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0 （ml）