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1. 代谢组学实验原理
代谢组学（metabolomics）是在后基因组学时代兴起的一门跨领域学科，其 主要目标是定量的研究生命体对外界刺激、病理生理变化、以及本身基因突变而 产生的其体内代谢物水平的多元动态反应[1]。代谢组学诞生于上个世纪末，由英 国伦敦帝国大学 Jeremy Nicholson 教授创立，之后得到迅速发展并渗透到多项领 域，比如疾病诊断、医药研制开发、营养食品科学、毒理学、环境学，植物学等 与人类健康护理密切相关的领域。
样品名称 Control （C）
Tb （Tg）

数量 20 20
样品状态 液体 液体
4.2 样本预处理方法
4℃环境下取每个样本 100 μL，加入 400 μL 预冷甲醇/乙腈溶液（1:1，v/v），涡 旋混合 30 s， -20℃静置 20 min，14000 g 4℃离心 15 min，取上清 400 μL，真空 干燥，质谱分析时加入 100 μL 乙腈水溶液（乙腈：水=1:1，v/v）复溶，涡旋， 14000 g 4℃离心 15 min，取上清液进样分析。
4.3.2 Q-TOF 质谱条件
分别采用电喷雾电离（ESI）正离子和负离子模式进行检测。样品经 UHPLC 分 离后用 Triple TOF 6600 质谱仪（AB SCIEX）进行质谱分析。 HILIC 色谱分离后的 ESI 源条件如下：Ion Source Gas1（Gas1）：60，Ion Source Gas2（Gas2）：60，Curtain gas （CUR）：30，source temperature：600℃，IonSapary Voltage Floating （ISVF）±5500 V（正负两种模式）；TOF MS scan m/z range： 60-1000 Da，product ion scan m/z range：25-1000 Da，TOF MS scan accumulation time 0.20 s/spectra, product ion scan accumulation time 0.05 s/spectra；二级质谱采用 information dependent acquisition （IDA）获得，并且采用 high sensitivity 模式， Declustering potential（DP）：±60 V（正负两种模式），Collision Energy ：35 ±15 eV，IDA 设置如下 Exclude isotopes within 4 Da，Candidate ions to monitor per cycle：6。
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代谢组学分析（metabolomics） 实验报告
项目名称： 委托单位： 项目编号： 检测人员： 核验人员： 技术服务部负责人： 报告时间：
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目录
1. 代谢组学实验原理........................................................................................................ 3 2. 项目实验流程................................................................................................................ 4 3. 实验仪器和试剂............................................................................................................ 5 4. 实验方法........................................................................................................................ 5 4.1 样品信息 ......................................................................................................................... 5 4.2 样本预处理方法 ............................................................................................................. 5 4.3 色谱-质谱分析................................................................................................................ 6 4.4 数据处理 ......................................................................................................................... 7 5. 实验结果........................................................................................................................ 7 5.1 实验质量控制 ................................................................................................................. 7 5.2 各组样本的典型代谢谱图 ............................................................................................. 9 5.3 数据分析 ....................................................................................................................... 11 6. 差异代谢物 KEGG 代谢通路分析............................................................................. 17 7. 实验结论...................................................................................................................... 17 8. 参考文献...................................................................................................................... 18 9. 附件总结...................................................................................................................... 18
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4.3 色谱-质谱分析
4.3.1 色谱条件
样品采用 Agilent 1290 Infinity LC 超高效液相色谱系统（UHPLC）HILIC 进行分 离。柱温 25℃；流速 300 μL/min；进样量 2 μL；流动相组成 A： 水+25 mM 乙 酸铵+25 mM 氨水，B：乙腈；的梯度洗脱程序如下：0 --- 1 min，为 85% B ； 1---12 min，B 从 85%线性变化到 65 % ；12---12.1 分钟 B 从 65%线性变化到 40%， 12.1--- 15 min，B 维持在 40% ；15-15.1 分钟---B 从 40%线性变化到 85%，15.1--20 分钟，B 维持在 85%；整个分析过程中样品置于 4℃自动进样器中。为避免仪 器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。样本队列中 每间隔 5 个实验样本设置一个 QC 样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数 据的可靠性。
基于超高效液相色谱-Q-TOF MS 的非靶向代谢组学分析流程一般包括：样 品预处理、代谢物提取、LC-MS 全扫描检测、数据预处理、统计分析及差异物 结构鉴定。本实验采用 HILIC UHPLC-Q-TOF MS 技术结合数据依赖采集方式对 样本进行全谱分析，同时获得一级质谱和二级质谱数据，随后采用 XCMS 对数 据进行峰提取和代谢物鉴定，简单工作流程见图 1[4]。
4. 实验方法
4.1 样品信息
待测样本信息：共 2 组样本，每组 20 份生物学重复样本（样本具体信息见表 1）。 质控样本（QC）的制备：分别取每个样本 20μL，混合为 QC。QC 样本用于测定 进样前仪器状态及平衡色谱-质谱系统，并用于评价整个实验过程中系统稳定性。
样品分组 1 2
表1 样品信息
从分析技术的角度来看，非靶向代谢组学是尽可能多地定性和相对定量生物 体系中的代谢物，最大程度反映总的代谢物信息。针对生物样本中小分子代谢物 种类多、极性跨度大和浓度动态范围大的特点，色谱-质谱技术成为代谢组学研 究最重要的工具。LC-MS是以高效液相色谱作为分离系统，高分辨率质谱为检测 系统的一种串联分析平台；与其他色谱-质谱联用技术相比，LC-MS更适用于分 析难挥发或热稳定性差的代谢物。超高效液相色谱通过应用1.7 μm超细粒径填料 填充的色谱柱，比传统HPLC的分析速度至少提高1倍，灵敏度和分离度提高数倍 [2]，目前，超高效液相色谱与四级杆-飞行时间（Q-TOF）质谱联用技术已被广泛 用于代谢组学研究。亲水相互作用色谱（HILIC）是专门针对强极性代谢物而开 发的色谱柱，因拥有和反相色谱（RPLC）互补的选择性而得到广泛重视和应用。 研究表明，HILIC-ESI（±）-Q-TOF MS能提供中心碳循环代谢的最大信息量[3]。