① 顺乌头酸酶催化柠檬酸异构化 为柠檬酸，反应分两步进行， 经历一个顺乌头酸中间体。 ② 反应具有严格的空间特异性。
顺乌头酸酶活性 位点的铁硫聚簇
(三) 异柠檬酸氧化生成－酮戊二酸
COO－ COO－ | | NADH CH2 CH2 | | － H－C－COO H－C－COO－ | | 异柠檬酸 HO－C－H C＝O 脱氢酶 | | － COO COO－
C=O CH3 S S
NAD
3
TPP lipoate FAD
CO2
S~CoA
C=O
E1+E2+E
Mg2+
NADH
CH3
CH3－C－S || O TPP E1
FAD
E2
E3
TPP
E1
E2
E3
FADH2
HS
HS
4. 二氢硫辛酰胺脱氢 酶(E3)使还原的二氢 硫辛酰胺脱氢,同时将 氢传递给FAD。
TPP
E1
Go 35.5 kJ mol
① 催化此反应的酶为-酮戌二酸脱氢酶复合体，该酶由-酮戌二酸 脱氢酶E1、二氢硫辛酰转琥珀酰酶E2和二氢硫辛酰脱氢酶E3及 六种辅助因子TPP、硫辛酸、CoA、NAD＋、FAD、Mg2＋组成； ② 反应为TCA二次氧化脱羧中的第二个反应； ③ 反应释放的能量主要存于琥珀酰CoA的高能硫酯键中； ④ -酮戌二酸脱氢酶是变构调节酶，其活性受产物琥珀酰CoA、 NADH和高能ATP的变构抑制。 ⑤ 与丙酮酸脱氢酶复合体中E1不同的是该酶不受磷酸化与去磷酸化 的共价修饰调节作用；
二氢硫辛酰胺转乙酰酶(E2)
辅酶 TPP 硫辛酸 CoA-SH
寡聚体
亚基数
哺乳动物 E.coli Mammals E.coli α2β2 α60 α α24 20-30 1 12 1
NAD 二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3) FAD＋
α2
α2
6
6
1. 丙酮酸 脱羧形成羟 乙基-TPP
CO2 O || CH3－C－COO－
R－As＝O ＋ HS HS R
R’－As
S S R
＋ H2O
二、TCA循环概貌
NAD+ O || H3C－C－COO－ NADH2
丙酮酸脱氢酶复合体
CoA-SH CO2
苹果酸脱氢酶
L-苹果酸
HO | H C－COO－ + NAD | － H2C－COO
O 柠檬酸合酶 || H3C－C－S－CoA CoA－SH O＝C－COO－ | H2C－COO－ H2C－COO－ | Oxyloacetate 2O H HO－C－COO－ NADH
NAD
GDP+Pi GTP
⑥
FAD
CO2
NADH+H+
⑤ CoASH
④ CoASH
CO2
四、柠檬酸循环的化学总结算
AcetylCoA 3NAD FAD GDP Pi 2H 2O 2CO2 3NADH FADH 2 GTP 2H CoA
① 离开循环的二分子CO2的碳并非来自进入循环的乙酰辅酶 A，而分别来自异柠檬酸脱羧和-酮戌二酸脱羧反应； ② 每循环一次共产生一个GTP、消耗二个水分子； ③ 每一次循环有4次氧化反应，共产生3分子NADH和1分子 FADH2； ④ 每次循环产生的能量：1 (GTP)＋3×2.5 (NADH)＋1×1.5 (FADH2)＝10 ATP ⑤ 若从丙酮酸算起则产生：10＋2.5 (NADH)＝12.5 ATP ⑥ 若从葡萄糖算起则产生：12.5×2＋2＋2 (NADH) ×2.5＝ 32 ATP
FAD和琥珀酸脱氢酶的共价结合
琥珀酸脱氢酶的铁硫聚簇
(七) 延胡索酸水合成L-苹果酸
HC－COO－ || －OOC－CH Fumarate
H2O
Fumarase
H2O
o
HO | H C－COO－ | H2C－COO－ L-malate
① 催化此反应的酶为延胡索酸酶； G 3.8 kJ mol ② 该酶具有严格的立体专一性，即只生成L-苹果酸；
2
|
H2C－COO－
柠檬酸
| |
Fumarase
顺乌头酸酶
H2C－COO－
H2O － 延胡索酸 HC－COO || －OOC－CH FADH2
FAD
Citric acid cycle
NAD+
HC－COO－
HC－COO－
|
琥珀酸脱氢酶
OH
异柠檬酸
NADH2 异柠檬酸脱氢酶 H2C－COO－ α-酮戊二酸 脱 琥珀酸 | 琥珀酰-CoA 氢酶复合体 CO2 H2C－COO－ 合成酶 NAD+ H2C－COO－ Pi | NADH H2C－COO－ 2 HC
Go ' 32.2kJ / mol
柠檬酸合酶 H2C－COO－
|
S－CoA | C＝O | CH3
HO－C－COO－ ＋ CoA-SH
|
H2O
H＋
H2C－COO－ Citrate
Oxaloacetate Acetyl CoA
柠檬酸合成酶的单聚体 形式，绿色原子为柠檬 酸，粉色原子为CoA
① 催化此反应的酶为柠檬酸合酶； ② 反应的中间产物为柠檬酰辅酶A； ③ 柠檬酸合酶属于调控酶，其活性受ATP、NADH、 琥珀酰CoA、酯酰CoA等的抑制；另一种抑制剂 是丙酮酰CoA。 ④ 它是TCA循环的限速酶，由氟乙酸形成的氟乙酰 CoA可被该酶催化形成氟柠檬酸，从而抑制下一 步的顺乌头酸酶催化的反应。此称为致死性合成 反应。
S S
Lipoamide
二氢硫辛酰胺
脱氢酶
(E3)
FAD
CO2
O O || || CH3－C－C－O－ Pyruvate
R
二氢硫辛酰胺 HS 转酰基酶 E2
HS R
O || CH3－C－S－CoA
TPP
O || CH3－C－S HS
Acetyl-dihydrolipoamide R
CoA
砷化物对硫辛酰胺的毒害作用 有机砷化物和亚砷酸能与丙酮酸脱氢酶系中的E2辅基硫辛酰胺共价 结合，使还原型的硫辛酰胺形成失去催化能力的砷化物。这类砷化物 同样表现在对酮戌二酸脱氢酶系的抑制上。
(五) 琥珀酰CoA转化为琥珀酸并释放高能磷酸键
GTP H2C－COO－ Pi | SuccinyI-CoA Synthetase GDP, HS-CoA,
H 2C
|
O＝C－S－CoA
GDP, Pi
HS-CoA, GTP
H2C－COO－ | H2C－COO－
Go 2.9 kJ mol
GDP GTP
Carbohydrate Metabolism 3
Tricarboxylic acid cycle
To teach is not to fill a vase but to light a fire
在有氧的情况下，葡萄糖酵解产生的丙酮酸氧化脱羧形成乙酰CoA。 乙酰CoA经一系列氧化和脱羧, 最终生成CO2和H2O并产生能量的过程, 称 为柠檬酸循环, 亦称为三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle), 简称TCA循环。 由于它是由H.A.Krebs（德国）正式提出的，所以又称Krebs循环。
S
S
OH S | S CH3－C－H | TPP E1 E2
E3
2. 由二氢硫辛 酰胺转乙酰 FAD 酶(E2)催化 形成乙酰硫 辛酰胺-E2。
HS
TPPFAຫໍສະໝຸດ E1E2E3CoA-SH
COONADH2
5. 在二氢硫辛酰胺脱氢 酶(E3)催化下,将FADH2 上的H转移给NAD+,形成 NADH2。 NAD
(四) -酮戌二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA
H2C－COO－ | H2C
|
NAD
NADH
O＝C－COO－
α-ketoglutarate
α-ketoglutarate dehydrogenase complex
H2C－COO－
| |
H2C
O＝C－S－CoA
HS-CoA CO2
succinyl CoA
CO2
COO－ | CH2 | CH2 | C＝O | COO－
Isocitrate
Oxalosuccinate
α-ketoglutarate
Go ' 20.9kJ / mol
① 催化此反应的酶为异柠檬酸脱氢酶； ② 反应为TCA二次氧化脱羧中的第一个反 应； ③ 反应中间产物为不稳定的草酰琥珀酸； ④ 既有以NAD+为辅酶的异柠檬酸脱氢酶， 也有以NADP+为辅酶的异柠檬酸脱氢酶。 ⑤ 异柠檬酸脱氢酶是变构调节酶，其活性 受ADP和NAD+的变构激活，受ATP和 NADH的变构抑制。
(二) 柠檬酸异构形成异柠檬酸
COO－ | CH2 | HO－C－COO－ | 三级醇 CH2 | COO－
H2O
分类 根据所含羟基的多少，可分为一元、二元、三元或 多元醇。一个碳原子上一般不能含有两个羟基，同碳二醇 不稳定，容易失水形成羰基化合物。醇也可按照连接羟基 的碳原子上氢的数目分为一级醇、二级醇和三级醇。
CoA-SH
琥珀酸
琥珀酰CoA合成酶反应机制
① 催化此反应的酶为琥珀酰CoA合成酶或称琥珀酰硫激酶； ② —该反应为TCA是唯一直接产生高能磷酸键的步骤，也是一步底物 水平磷酸化产生能量的步骤； ③ —反应生产的GTP在蛋白质的生物合成中起磷酰基供体及激活信 号蛋白的作用，也可以与ADP磷酸化生成ATP相偶联产生能量。
(六) 琥珀酸脱氢生成延胡索酸
| H2C－COO－ H2 C－COO－