植物抗病基因研究进展摘要:植物抗病基因的研究是目前植物病理学科的热点及难点之一。

近年来，通过基因工程技术培育抗病毒植物已经成为抵抗植物病毒的有效手段。

本文简要讨论了近年来植物抗病毒基因工程的方法策略, 并对植物抗病基因工程的研究取得的成绩、存在的问题及展望进行了简介。

关键词植物病毒、抗病基因、基因工程、前景一、植物抗病基因工程原理植物抗病基因工程指的是用基因工程（遗传转化）的手段提高植物的抗病能力，以此获得转基因植物的方法。

植物抗病基因工程主要包括：抗病及其他相关基因的分离和克隆、与合适的载体及标记基因构成适于转化的重组质粒、用不同的转化方法向受体植物导入重组质粒、筛选转化因子并鉴定转基因植株。

此外，还有一种可以获得抗病转基因植物的方法即把具有抗病能力的植物或微生物的DNA 直接导入受体植物，从后代中筛选具有抗病能力的个体，经过稳定转化得到转基因抗病植株。

植物病毒每年给世界各地的农作物生产造成严重损失，每年全世界的农作物因病毒侵害的损失数百亿美元，传统的防治方法已远远无法满足现代农业的生产要求。

病毒侵染之所以复杂，在于一方面病毒的高突变率所致的植物抗病品种抗性丧失速度远高于常规植物抗病育种速度；另一方面病毒在隐症野生植物中的储存；第三，无亲缘关系的病毒复合侵染以及病毒侵染的持久性，特别是以线虫和真菌传播的植物病毒能在土壤中存活许多年。

因此，在适宜病毒介体生长的温度条件下，大面积连作缺乏抗病基因的植物，造成的经济损失会更高。

Hamilton[1]于 20 世纪 80 年代初首先提出了基因工程保护的设想，在转基因植物中表达病毒基因组序列可能是防御病毒侵染的途径之一。

近 20 多年来，基因工程的发展，为防治病毒病开辟了新途径。

二、利用非病毒来源的基因策略1.植物自身基因介导的病毒抗性一些植物在病毒侵染的时会启动主动防御机制，最普遍最常见的主动防御机制就是通常所说的过敏反应，也就是那些最初被病原侵染点周围的细胞发生程序性死亡最终在病原最初侵染点周围形成坏死斑。

如番茄中的 Tm-1 或 Tm-2 和Tm-22基因，马铃薯的 Rx，Ry，烟草中的 N 基因等等[2]。

这类基因通常称为 R 基因。

根据其抗性水平的不同还分为：真实免疫指病毒复制完全不能发生、阈下侵染指病毒的复制仅局限于受侵染的细胞。

不管 R 基因是在模式植物还是在不同的作物品种中，所有的 R 基因编码的蛋白质分别具有富亮氨酸重复结构或丝氨酸 -苏氨酸蛋白激酶结构[3]。

这些植物基因如何识别病原物或病原物的基因产物，以及因此而产生抗性的机理仍不清楚。

姜国勇[4]研究小组通过对 Tm-22基因转化体在不同启动子的调控下，对 ToMV-2a 毒株感染所表现的症状不同，说明启动子在 Tm-22基因的抗病反应中具有非常重要作用。

只有当携带无毒基因的病原携抗性基因的寄主互作是，二者才表现不亲和性，既寄主表现抗病；其他情况下，二者均表现亲和，即寄主感病。

基因对基因的观点已在包括真菌、细菌、病毒和线虫等植物病害的研究中得到广泛证明。

利用植物自身编码的抗病毒基因策略，通过基因工程技术培育抗病品种能克服常规育种周期长的特点。

但由于在自然条件下许多植物不存在抗性基因或者目的基因的分离和鉴定存在一定的难度，更重要的是自然界中病毒的繁殖突变速度是相当惊人的，只要其某个氨基酸发生了变异就能使病毒克服植物抗病毒基因的抗性。

所以由于其复杂性利用植物自身的抗病毒基因的策略在植物抗病毒基因工程的研究中还不是主要的。

2. PR 蛋白基因病程相关基因介导的抗性这是一类当植物受病原物侵染或其他因子的刺激、胁迫产生的一类蛋白质。

PR 蛋白根据分子生物学特性和血清学关系可分为5组，（ PR1-PR5），其中 PR-1 与病毒抗性关系密切，其抗病机理可能是它们参与植物细胞壁抗侵染的作用，还有的认为这组PR蛋白可能是靠协调作用才能抵抗病毒。

但至今，转PR蛋白基因的植物其抗性水平并不理想。

3.潜在自杀基因将植物来源的毒素蛋白(如抗病毒蛋白等) 基因克隆到某种病毒的启动子下游,再将这一重组体以反义形式克隆到植物表达载体中并转化植物。

植物体内转录出包含病毒启动子与该病毒蛋白在内的复合物,但不会翻译表达有功能的活性毒素蛋白。

然而,一旦该种病毒侵染植物，其体内已经转录出的反义 RNA 会利用病毒酶系统转录出正义链的 mRNA ,mRNA 再翻译表达则产生有功能的活性毒素蛋白,结果,病毒侵染了的细胞死亡而邻近的细胞不受影响。

4.α、β干扰素基因它是一种小分子量蛋白，是脊椎动物在受病毒感染后分泌的一种蛋白，能结合在细胞膜上，形成抗病毒结构，它具有广谱抗性。

三、利用病毒起源的基因介导的抗性策略1.利用病毒外壳蛋白基因介导病毒抗性外壳蛋白基因介导的病毒抗性是研究最早也是目前比较成功的抗病毒手段，该策略主要是将病毒的外壳蛋白基因进行体外克隆体外重组及构建表达载体然后将重组的基因转化到植物细胞内并得以表达从而使转基因植物获得抗病毒的能力。

自从 1986 年美国华盛顿大学 R.Beachy[5]研究小组通过植物基因工程技术，首次将烟草花叶病毒（ TMV）的 CP 基因导入烟草，培育出能稳定遗传的抗 TMV 烟草植株，开创了植物抗病育种的新领域。

迄今为止，科学者们已经克隆了至少15 个病毒组中 30 种病毒的 CP 基因并成功转化了 20多种植物有些株系已进入田间试验并显示了与实验室一致的抗病效果[6]。

目前关于 CP 基因介导的抗性机理主要有以下几种观点：a、CP 的表达抑制了病毒的脱壳转基因植物细胞内大量游离的衣壳蛋白亚基的存在使病毒基因组的 5’端难以释放阻碍了病毒的脱壳。

b、CP 干扰病毒 RNA 的复制，当入侵病毒的裸露核酸进入植物细胞后，它们立即被植物细胞中的自由 CP 所重新包裹，阻止了核酸的复制。

c、CP 限制了病毒粒子的扩展和转运：Wisniewski[7]等人证明在转 TMV-CP 基因的植株中，在接种 TMV 后，不仅阻碍了TMV 在接种叶上的扩展速率，而且也降低了TMV 从接种到上部叶的系统转运。

d、抗性的产生是由于 CP 基因表达的mRNA 与病毒 RNA 之间相互作用的结果。

2.复制酶介导的保护作用复制酶是指由病毒编码的能特异合成病毒正负链RNA 的 RNA 聚合酶其核心功能是合成全长的病毒基因组RNA。

该策略就是通过在植物中表达完整的复制酶、复制酶亚基基因后者是突变或缺失的复制酶基因序列从而使转基因植物获得病毒抗性。

关于复制酶的抗性机制目前还没有准确的定论，大家推测，其介导的抗性既可以在蛋白质水平上也可以在 RNA 水平上。

在 RNA 水平上，Lomonosslf[8]等认为转入的 mRNA 与病毒的复制酶进行无效结合抑制了复制酶的正常功能，或者是 mRNA 诱导了植物的自然抗病性。

在蛋白质水平上，Suzuki[9]等认为复制酶基因在蛋白质水平上介导的抗性包含两种作用模型:模型 1: 转基因植物表达的完整复制酶蛋白在病毒的自然侵染过程中作为一种调节蛋白发挥正常的功能, 从而打破了病毒正链和负链复制的平衡, 或者扰乱了控制复制酶活性的反馈抑制途径。

模型 2: 转基因植物表达的突变型或缺损型的复制酶蛋白, 在复制酶复合体的装配过程中, 与野生型复制酶竞争由寄主或病毒编码的复制酶复合体的其它成分, 或者竞争其它寄主因子或底物, 从而使野生型复制酶不能正常行使其功能, 干扰病毒的复制。

复制酶介导的抗性还涉及到其它机制, 显示了抗性机理的复杂性。

3.利用病毒运动蛋白基因介导的病毒抗性植物病毒侵染宿主植物后在体内的运转方式主要有两种，一是通过植物维管组织进行的系统转移，二是通过胞间连丝在细胞之间的移动。

病毒在细胞间的移动是一主动的过程，需要病毒编码的蛋白参与，这种蛋白称移动蛋白。

移动蛋白基因介导的抗性机理：主要是利用编码失去活性的病毒移动蛋白的基因干扰病毒的扩散和移动。

4.利用卫星 RNA 介导的抗性病毒卫星 RNA 是一类依赖于辅助病毒才能复制的低分子量 RNA，它不能编码外壳蛋白，只装配于辅助病毒的外壳蛋白中，其复制必须依靠辅助病毒进行。

卫星 RNA 的抗性机理现在一般认为是卫星 RNA与病毒基因组 RNA 争夺病毒复制酶位置，最终以数量优势抑制了病毒基因组的复制。

卫星 RNA 介导抗性具有以下的优点和不足，一方面卫星 RNA 只需很低的表达，就能使植株获得高抗，而且这种抗性并不产生特异蛋白，这样提高了转基因植物的生物安全性。

另一方面，对转化植株起保护作用的卫星 RNA 一旦被病毒包装传播到其他植物，可能会引起严重的症状。

还有卫星 RNA 有可能变成毒性卫星 RNA，从而失去对病毒的防治作用，加重病毒症状。

5.利用核酶基因介导的抗性策略核酶是一类具有特殊二级结构, 能特异性催化切割自身以及其它 RNA 分子的小分子 RNA，其结构可以分为锤头型和发夹型两类。

锤头型核酶较为普遍,其专一切割靶 RNA 内紧邻该切割位点下游的磷酸二酯键。

任何生物的 RNA 都可以作为核酶的底物,而且核酶对底物作用位点的碱基序列要求不严格。

根据这一特性, 人们可以设计成用来切割已知序列的病原性RNA 的人工核酶。

王苏燕等人利用核酶等策略在转基因油菜中产生了对花椰菜花叶病毒 CaMV 的高度抗性[10]。

另一方面因为任何生物的 RNA 都可以作为核酶的底物所以我们也要注意其可能将生物体内有用的RNA 作为靶进行切割，破坏正常细胞的生理功能。

四、植物抗病基因工程的前景展望植物基因工程是细胞水平和分子水平上的遗传操作，其最大优点是能地利用人们所感兴趣的外源基因使工作更具目的性，给植物抗病育种提供了一条有用的途径。

但是抗病基因所介导的抗病性具有高度专化性，只针对一种病害的一个或几个小种，抗病谱范围比较窄；而导入防卫反应基因的转基因植株大多表现出部分抗性。

因此，多数转单基因的抗病植物，抗病机制单一，抗多病害或抗多小种的能力低，一旦病原菌群体发生变化，抗病性就可能被克服。

因此植物抗病基因工程的趋势是创建持久、广谱的抗病性。

随着生物技术的发展,新的抗病毒策略不断涌现,如利用病毒弱毒株的全长cDNA、植物的自杀基因等.目前,为进一步提高工程植株的抗病性,人们多采用复合基因策略,即转多种抗性基因控制一种病毒,可以提高转基因植物的抗性强度和抗病的持久性;转多种抗性基因控制病毒的复合侵染,可以提高转基因植物抗病的广谱性,这是转基因抗病毒育种产业化发展的趋势.因为一种植物在自然条件下常受多种病毒的侵染,只有抗多种病毒的转基因植物,才能达到控制病毒病害的目的。

综上所述，植物抗病基因工程要获得深入发展，加强相应的基础研究是十分重要的。

病原菌致病手段多种多样，植物的防卫机制也是多方面的，随着植物抗病机制的深入研究，抗菌基因工程的策略和手段也会得到不断拓宽，必将在植物病害防治中发挥更大的作用。