第二部分：免疫检验技术
1.沉淀反应
①可溶性抗原；②多克隆抗体更适合；③R型血清首选
液相沉淀试验
环状沉淀试验：定性
絮状沉淀试验
抗体稀释法、棋盘格法（找出Ag、Ab最佳比例）
凝胶沉淀试验
单向扩散试验
定量试验；两个曲线
双向免疫扩散试验(定性)
沉淀线数目：抗原或抗体不纯；沉淀线弯向分子量大的；沉淀线靠近浓度低的；可以测定效价(半定量)
第一部分：基本理论
抗原抗体反应
抗原
抗原的两种特性：免疫原性、免疫反应性
共同抗原、交叉反应、异嗜性抗原、超抗原等
抗原的分类依据性能：完全抗原、不完全抗原
依据抗体产生是否要T cell刺激：胸腺依赖性抗原（TD-Ag）、 胸腺非依赖性抗原（TI-Ag）
丝裂原
刀豆蛋白A（ConA）
T细胞有丝分裂原
植物凝集素
间接血凝试验
载体颗粒为红细胞
其它凝集试验
抗球蛋白试验（Coombs试验）
是抗球蛋白参与的间接血凝试验
直接Coombs
检测已粘附在RBC的不完全抗体；新生儿溶血、自身免疫溶血性贫血
间接Coombs
血清中游离抗体；多用于检测母体Rh(D)
协同凝集试验
载体颗粒为SPA的间接凝集试验
冷凝集试验
检测冷凝集素的方法，0~4℃最明显
②定性试验
直接凝集试验
玻片凝集
定性；多用于红细胞ABO血型
试管凝集
半定量、多用于Ab；外斐试验、肥达试验
间接凝集试验
①将抗原与某一载体结合；②常用载体：人O型RBC、SRBC、SPA等
间接凝集试验
正向间接凝集试验
用抗原致敏颗粒检测抗体
反向间接凝集试验
用已知抗体检测抗原
间接凝集抑制试验
用已知抗原致敏颗粒和相应抗体，检测样本中是否有与致敏颗粒相同的抗原，有正向和反向
T细胞有丝分裂原
美洲商陆丝裂原
T细胞和B细胞有丝分裂原
脂多糖（LPS）
B细胞有丝分裂原
葡萄球菌A蛋白（SPA）
B细胞有丝分裂原
抗体
结构与功能：略
IgG
单体分子、血清和细胞外液中含量最高
IgM
五聚体、分子量最大、不能透过胎盘、宫内感染指标
IgA
有两种类型（血清型和分泌型）、对新生儿早期抗感染十分重要
IgD
橘红色粉末；激发后为橘红色荧光
四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)
紫红色粉末，激发后有橙红色荧光；猝灭速度慢
藻蛋白类
藻红蛋白PE(此类最常用)、藻青蛋白PC、别藻青蛋白APC；多呈现橙色或红色物质
荧光显微技术
光源
短波光；波长连续或不连续；
单体分子、膜结合型IgD是Bcell分化成熟的标志
IgE
单体分子、含量最少、特异性过敏和寄生虫感染中有意义
抗原抗体反应原理
结合力、亲和力与亲合力
抗原抗体反应特点
①特异性；②比例问题：等价带、前带、后带；③可逆性
影响因素
反应物
抗原
理化性质、抗原表位等
抗体
来源：R型血清和H型血清
特异性与亲和力
反应条件
电解质、酸碱度、温度、比例
抗原抗体的制备
免疫原的制备
颗粒性免疫原的制备
较简单、分离或纯培养
可溶性抗原的制备
粗抗原制备：捣碎组织、破碎细胞、粗提取
分离与纯化、浓缩与保存
人工免疫原的制备
将半抗原与载体结合，常用蛋白质作为载体
合成肽抗原的制备
合成肽属于半抗原的一种，所以·····
基因工程抗原的制备
获得目的抗原的基因编码，然后扩增纯化
双位点一步法
双抗夹心时，待测样品和酶标物一起加入
间接法
检测抗体最常用
竞争法
既可测抗原，又可测抗体；参考管和待测管对照观察
5.荧光免疫技术(F)
*阳性细胞数量和荧光强度可以作为定量或半定量指标
常用荧光物质
异硫氰酸荧光素(FITC)
最常用、最广泛；黄色或橙黄色粉末；激发后发出黄绿色
四乙基罗丹明(RB200)
免疫电泳
对流免疫CIEP
双扩+电泳；Ag向正极泳动、Ab向负极泳动
火箭电泳
单扩+电泳；定量
免疫电泳
先蛋白区带电泳、再双扩
免疫浊度测定（定量）
透射浊度测定、散射浊度测定
免疫速率抑制浊度测定
用一定量的已知半抗原-载体与限量特异性抗体反应，测定生成的半抗原-载体-抗体所造成的散色速率
2.凝集反应
①颗粒性抗原或带有可溶性抗原的载体
制备单克隆抗体：在小鼠腹腔诱生出肿瘤并产生含McAb的腹水
鉴定、保存、应用
基因工程抗体的制备
抗原抗体的纯化
离心分离
差速离心
粗分离；会有共沉；分离分子量相差大的物质；动力学方法
密度梯度离心
用于分离密度相近大小不同；常用介质为蔗糖、甘油；离心分离的物质密度一定要大于密度梯度介质的最大密度；有共沉
等密度梯度
抗体的制备
多克隆抗体制备
使用免疫原免疫动物获得抗体、又叫抗血清；
弗氏完全佐剂（CFA，石蜡油+羊毛脂+卡介苗）和弗氏不完全佐剂（IFA，石蜡油+羊毛脂）
大致过程：获取、鉴定、纯化、保存
单克隆抗体（McAb）制备
原理：杂交瘤技术等
亲本细胞的选择与融合：无菌取脾
HAT培养基的选择作用
阳性克隆选择与克隆化
亲和层析
利用欲分离物质和它们的特异性配体间பைடு நூலகம்有特异性亲和力
电泳
有支持体
纸电泳
醋酸纤维薄膜
薄层电泳（薄膜或薄板）
非凝胶性支持体区带电泳（淀粉、纤维素粉、硅胶等）
凝胶支持体区带电泳（淀粉液、聚丙烯酰胺凝胶）
无支持体
Tiselius移界电泳
显微电泳
等点聚焦电泳
等速电泳
密度梯度电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳区别
分离大小相同密度不同的物质；介质常用铯盐；铯盐对铝有腐蚀，防止溅出；不会有共沉
沉淀分离
盐析法
原理：盐的存在减弱了蛋白分子周围的水化膜，导致蛋白发生聚集而沉降
有机溶剂沉淀
优：分辨率高、溶剂易除；缺：有毒、可能会是蛋白失活
非离子聚合物沉淀
常用聚乙二醇
离子交换层析
凝胶层析
常用凝胶：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、Superdex
自身红细胞凝集试验
主要试剂为抗人O型红细胞MCAb，可以与各型RBC结合却不引起凝集；样本为全血
特点是排除由于红细胞凝集可能引起的假阳性
3.补体试验
系统：①缓冲液PBS②补体③SRBC④溶血素
补体测定试验
血清总补体活性(CH50)测定
活化经典途径；为么要50%溶血作为终点测定；意义
旁路活化途径(AP-H50)测定
EGTA螯合Ca2+，封闭Cl，阻断经典途径
补体结合试验
分为直接(不溶血为阳性)和间接(溶血为阳性)两类
实验结果要对照众多对照实验观察
4.酶免疫技术(E)
定量或定性
固相载体
最常用聚苯乙烯
酶和底物
最常用辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)；还有β-半乳糖胺酶
分类
双抗体(原)夹心
检测抗原最常用；只适用于二价或二价以上大分子抗原